我科学家用CRISPR获得转基因山羊

最近，来自西北农林科技大学、榆林学院、南京大学和上海科技大学等处的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表一项研究，通过将靶定MSTN和FGF5基因的Cas9 mRNA和sgRNA，向单细胞阶段受精卵的共注射，成功制备了一个或两个基因修饰的转基因山羊。

　　

生物通报道：CRISPR/Cas9系统的最新研究进展，提供了一种精确而灵活的方法，可在不同物种中进行基因组编辑。然而，这种方法在大型动物模型（如山羊）中的适用性和效率，还没有得以广泛的研究。最近，来自西北农林科技大学、榆林学院、南京大学和上海科技大学等处的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“Generation of gene-modified goats targeting MSTN and FGF5 via zygote injection of CRISPR/Cas9 system”的研究论文，通过将靶定MSTN和FGF5基因的Cas9 mRNA和sgRNA，向单细胞阶段受精卵的共注射，成功制备了一个或两个基因修饰的转基因山羊。延伸阅读：西北农林PNAS利用TALEN技术获抗结核转基因牛。

西北农林科技大学动物科技学院的陈玉林教授、榆林学院的屈雷博士、南京大学模式动物研究所黄行许教授和西北农林科技大学动物医学院的马保华教授，是本文共同通讯作者。

基因组编辑技术依靠使用工程核酸酶，来诱导细胞DNA修复机制，并在不同系统引入可编程的、位点特异性的遗传修饰。这些可编程的核酸内切酶包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs），以及最近开发的CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统采用短的、单向导RNA（sgRNA），识别靶DNA。与ZFN和TALEN相比，RNA引导的CRISPR/Cas9系统因其灵活、稳健的优势，已被用于不同物种的基因组编辑，包括模式生物、以及农作物和对农业非常重要的动物。

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山羊作为第一批驯养的农场动物，是最重要的家畜品种之一，可提供各种产品，包括纤维、牛奶、肉类和皮革制品。此外，山羊也被用作生物医学研究的模型。虽然研究人员已在山羊中建立了特定的基因敲除策略（基于同源重组HR和体细胞核移植SCNT），但是，山羊基因组的精确基因修饰，仍然是具有挑战性的。在以往的研究中，研究人员通过CRISPR/Cas9介导的方法，同时破坏山羊初级成纤维细胞的四个基因，只获得了肌生成抑制蛋白（MSTN）基因敲除的成纤维细胞，并通过SCNT产生了活产山羊。然而，抗生素选择标记盒，对于从种子供体细胞分离单细胞群落，通常是至关重要的，而且重建胚胎有较低的发育潜能，从而导致相对较低的SCNT打靶效率。Cas9 mRNA和sgRNA到单细胞阶段胚胎的共注射，已被证明是产生转基因小鼠、大鼠、猴和猪的一种有效方法，这将激励我们将这种策略应用到山羊的基因打靶中。

在这项研究中，研究人员将靶定两个功能基因（MSTN和FGF5）的Cas9 mRNA和sgRNAs，共注射到单细胞阶段的胚胎中，成功地产生了一个或两个基因被修饰的转基因山羊。在体外培养的原代成纤维细胞中，MSTN和FGF5的打靶效率高达60%，而在98只试验动物中，MSTN和FGF5的修饰效率为分别为15%和21%，双基因修饰的效率为10%。研究人员对成纤维细胞、以及建立者动物和死亡动物的身体组织和睾丸中靶基因的打靶和脱靶突变进行了详细分析。结果表明，他们在大型动物中同时获得了几个位点的编辑，从而表明CRISPR/Cas9系统有潜力成为一种强大而高效的农业动物基因工程工具，因此用于繁殖将是极为重要和适用的。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Generation of gene-modified goats targeting MSTN and FGF5 via zygote injection of CRISPR/Cas9 system
Abstract: Recent advances in the study of the CRISPR/Cas9 system have provided a precise and versatile approach for genome editing in various species. However, the applicability and efficiency of this method in large animal models, such as the goat, have not been extensively studied. Here, by co-injection of one-cell stage embryos with Cas9 mRNA and sgRNAs targeting two functional genes (MSTN and FGF5), we successfully produced gene-modified goats with either one or both genes disrupted. The targeting efficiency of MSTN and FGF5 in cultured primary fibroblasts was as high as 60%, while the efficiency of disrupting MSTN and FGF5 in 98 tested animals was 15% and 21% respectively, and 10% for double gene modifications. The on- and off-target mutations of the target genes in fibroblasts, as well as in somatic tissues and testis of founder and dead animals, were carefully analyzed. The results showed that simultaneous editing of several sites was achieved in large animals, demonstrating that the CRISPR/Cas9 system has the potential to become a robust and efficient gene engineering tool in farm animals, and therefore will be critically important and applicable for breeding.