让exosome提取如提质粒一般简单[新品推荐]

之前，外泌体（exosome）及其他细胞外囊泡（EV）一直是不起眼的灰姑娘，而最近诊断和治疗潜力的发现，仿佛给这些小囊泡穿上了水晶鞋，使其一晃变成光彩夺目的公主。

众所周知，细胞不断向细胞外空间分泌大量的小囊泡。这些小囊泡的直径大多为50-200 nm，脂双层结构，介导了细胞间的运输。至于运输了什么，人们没有太在意，大抵是一些不重要的蛋白吧。直到最近，人们才发现他们错了。exosome及其他细胞外囊泡正起着不可缺少的细胞通讯作用。

小囊泡，大潜力

在肿瘤发展过程中，exosome介导了关键的步骤，如刺激血管生成，削弱免疫反应，甚至参与了转移前微环境的形成。在正常的生理和妊娠过程中，exosome也起了重要作用，如胎盘exosome帮助形成对母亲免疫系统的免疫抑制屏障。总之，在正常和病理的条件下，细胞都释放小囊泡，以各种方式影响其他细胞。

这些囊泡中的核酸成分，尤其是RNA，引起了人们的极大兴趣。相对于血液中那些“无瓦遮头”的RNA，囊泡为RNA创造了一个天然的稳定环境，保护它们免受RNase的降解。通过RNA-Seq、杂交芯片及其他方法的分析，人们发现囊泡中存在过去未知的各种转录本，包括miRNA和其他种类的小分子非编码RNA，以及mRNA、tRNA、lncRNA和rRNA。

因此，exosome及其他细胞外囊泡有望作为生物标志物，在癌症及其他疾病的诊断中发挥一定的作用。囊泡的脂双层结构使得新鲜和长期保存的样本皆可用于RNA分析，甚至一些冷冻达十二年之久的样本也能产生高质量的RNA。当然，我们首先得分离出这些小囊泡。

超速离心是分离小囊泡的常用方法，产量高，质量也OK，不过首先你得有一台超速离心机。而且，整个过程耗时耗力，还需要精心优化操作。目前没有标准化的操作可循，实验室使用不同的前处理以及不同的超速离心操作。这就使得各个实验室之间的结果几乎没办法比较。后来，人们又开发出多种替代方法，如抗体捕获、聚合物沉淀等，有一定的作用，但也存在一些缺点。

为此，Exosome Diagnostics公司开发出一种基于离心柱的简便方法来分离EV，并提取出其中的RNA。上个月，研究人员在《PLoS ONE》上介绍了这种新方法。与超速离心相比，这种方法能分离出高纯度的RNA，并且对囊泡RNA有着高的特异性。离心柱能够容纳4 mL样本，实现了血清和血浆中低丰度转录本的检测。目前，基于此技术的商业化产品 – exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit – 已由QIAGEN推出。文章以此为例进行了详细介绍。

离心柱，更方便

这种方法使用了膜亲和结合步骤来分离exosome及其他EV。它无法通过大小或细胞来源对EV进行区分，也不依赖于是否存在微粒表位。它运用了囊泡的通用生化特性来提取样本中的所有细胞外囊泡。因此，在开始提取前需要对样品进行离心或过滤操作，以便完全去除细胞、细胞碎片、凋亡小体等组分。

整个实验流程，从血清/血浆样本到RNA产物，只需1小时。实验包括两步：纯化exosome和分离RNA。在exosome纯化步骤，预过滤的血浆与结合缓冲液（XBP）混合后，加至exoEasy亲和性膜离心柱上，让囊泡与膜结合。离心之后，使用洗涤缓冲液（XWP）洗涤结合在膜上的囊泡，之后利用QIAzol裂解。在RNA分离步骤，QIAzol洗脱液中加入氯仿，回收水相，将其与乙醇混合。总RNA结合到离心柱上，洗涤三次后洗脱。

研究人员发现，与超速离心法相比，新的方法不仅速度更快，而且产物纯度更高。扫描电镜显示，虽然这两种纯化技术都能够纯化预期大小（50-200 nm）的完整的囊泡，但超速离心的产物还含有很多不符合预期、更小或其他形状的细胞结构（图1）。

 
图1：分离后囊泡的扫描电镜分析。左：超速离心法；右：exoEasy的洗脱物（图片来自PLoS ONE）

既然exosome及其他细胞囊泡有望用于生物标志物的发现和诊断的开发，那么RNA制备的质量和重复性可是相当重要的。为此，研究人员也使用Bioanalyzer对这两种方法分离的囊泡RNA大小进行分析。他们对血浆进行预过滤（0.8 µm），去除较大的微粒，之后通过目前常用的超速离心法，或exoRNeasy方法分离囊泡。分析表明，两种方法纯化所得的RNA在大小和产量上相似。

 
图2：癌症患者血浆的总RNA大小分布图。（图片来自PLoS ONE）

至于离心柱分离了哪些种类的RNA，研究人员也进行了深究。他们使用最小的起始样品量0.2 mL，利用RT-qPCR对exoRNeasy纯化的RNA产物和exoEasy分离柱的流出液进行分析。结果显示，exoRNeasy的产物包括血浆中所有mRNA，以及特定的miRNA，如let-7a和miR-142-3p（图3）。同时，一些无细胞的循环miRNA和与Ago2蛋白结合的miRNA则保留在流出液中。

 
图3：血浆中mRNA和miRNA的回收。（图片来自PLoS ONE）

这种离心柱的方法不仅简便，也能够扩展。当样本体积有限，或感兴趣的转录本以高拷贝数存在时，你可以使用200 μL或更少的体积；而对于稀有转录本的检测，或下游分析是芯片或测序时，你也可以使用4 mL或更多的体积。你看，就是这么任性。

研究人员认为，这种基于离心柱的新方法与现有的产品和操作相比，展现出相当或更好的RNA产量和纯度，同时可适应大范围的样品量，实现低丰度转录本的检测。它特异性分离EV中包含的RNA，而排除蛋白相关的循环RNA，带来了一个方便快捷的流程，适合常规使用。

囊泡，快到碗里来

也许，你更感兴趣的是囊泡本身，而不是其中的RNA。那么，你可以试试QIAGEN新的exoEasy Maxi Kit。它可从血浆、血清及细胞培养上清中纯化exosome及其他EV。

exoEasy Maxi Kit的原理同上，使用离心柱及专门的缓冲液来从预过滤的生物液体中纯化exosome；可处理高达4 mL的血浆或血清。对于细胞培养上清，经实验验证可从高达32 mL的样品中成功提取exosome。不过，上清中的囊泡浓度依赖于细胞类型及培养条件；因此QIAGEN建议上清体积不要超过16 mL。更高的样品体积可能导致囊泡的回收率降低。

整个流程仅仅需要25分钟。将预先过滤过的血浆、血清或细胞培养上清与Buffer XBP进行混合并结合在exoEasy膜亲和离心柱上。对结合的exosome使用Buffer XWP进行清洗，随后使用Buffer XE（主要含无机盐的缓冲液）进行洗脱，即可用于物理或生化分析。不过，对于生物检测等特定应用，可能需要进行额外的浓缩或缓冲液置换。此步骤可通过孔径尺寸为100 kDa或更小的超滤方法来实现。

提取获得的囊泡具有完整的功能，可用于多种下游应用。比如通过纳米颗粒追踪分析（NTA）或可调电阻脉冲感应（TRPS）对其物理性质进行分析，或者利用电子显微镜分析。当然，你也可以提取出其中的DNA、RNA、蛋白或脂类，开展进一步的分析。

现在，你是不是对exosome分析如释重负了呢。没有超速离心机，只有普通离心机，我们一样能获得高纯度的exosome。

目前，QIAGEN提供了四种exsome研究相关试剂盒。 exoRNeasy Maxi kit用于exosome分离；其他三种纯化囊泡RNA的试剂盒，Maxi最多可处理4 mL的血清/血浆；Midi的处理量不大于1 mL。如果你需要处理不同起始量的样品，Starter Kit则最合适。

产品	规格	货号
exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (50)	For purification of total exosome-derived RNA from up to 4 ml serum/plasma; includes 50 exoEasy Maxi columns and 50 RNeasy MinElute spin columns	77064
exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit (50)	For purification of total exosome-derived RNA from serum/plasma; includes 50 exoEasy Midi columns and 50 RNeasy MinElute spin columns	77044
exoRNeasy Serum/Plasma Starter Kit (20)	For purification of total exosome-derived RNA from serum/plasma; includes 20 exoEasy columns (10 Maxi, 10 Midi) and 20 RNeasy MinElute spin columns	77023
exoEasy Maxi Kit (20)	For 20 vesicle preps: 20 exoEasy Maxi Spin Columns, Collection Tubes (50 ml), Reagents and Buffers	76064

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（生物通 余亮）

参考文献：

Enderle D, Spiel A, Coticchia CM, Berghoff E, Mueller R, Schlumpberger M, et al. (2015)
Characterization of RNA from Exosomes and Other Extracellular Vesicles Isolated by a Novel Spin Column-Based Method. PLoS ONE 10(8): e0136133. doi:10.1371/journal.pone.0136133