弥补ChIP-seq缺陷的新工具

最近，研究人员开发出一种新技术，可精确地标记“称为转录因子的调控蛋白，是在活细胞的细胞核中哪个部位与DNA相互作用”。这项新技术被称为SpDamID，发表在八月六日的《分子细胞》杂志（Molecular Cell），可让科学家回答现有技术无法解决的、有关“组织发育和疾病”的基本问题。

　　

生物通报道：最近，研究人员开发出一种新技术，可精确地标记“称为转录因子的调控蛋白，是在活细胞的细胞核中哪个部位与DNA相互作用”。

美国辛辛那提儿童医院医学中心的科学家，将这项研究结果发表在八月六日的《分子细胞》杂志（Molecular Cell）。这项新技术被称为SpDamID，可让科学家回答现有技术无法解决的、有关“组织发育和疾病”的基本问题。

本文资深作者、辛辛那提儿童医院发育生物学主任Raphael Kopan博士指出：“这项技术的进一步发展，将使研究人员深入探讨用现有工具无法回答的生物学问题。这种方法可能会改变我们的研究。”

细胞过程主要是由多种转录因子的共同作用而调节的，转录因子是结合染色体上特定DNA位点的蛋白质，可指引细胞应该做什么。疾病的过程通常开始于转录因子中的突变，或它们结合的DNA。这些遗传变异可能导致细胞生长失控，逃避免疫系统，或不能执行保持健康所必需的基本功能。

要了解有缺陷的疾病过程，研究人员需要追踪转录因子在何处以及如何与DNA相互作用，以确定健康细胞和患病细胞之间的差异。考虑到人类基因组的大小，目前用于跟踪蛋白质基因相互作用的研究方法，可能是繁琐的、耗时的，而且不总是确定性的。

今天常用的一种流行方法，被称为染色质免疫沉淀，结合新一代基因测序（ChIP-seq）。ChIP-seq的缺陷在于，它不能提供单个细胞中转录因子结合的确切细节，因为它采集的样本事件发生在细胞暴露于各种有毒化学物质之后。关于一条DNA单链被不同转录因子占用的任何结论，都是基于推论。延伸阅读：掌握技巧，做好ChIP-Seq并不难[创新技巧]。

研究人员报道称，Kopan及其同事Matthew Hass博士开发的SpDamID技术，对于这些分析来说，是一种精确、快速和有效的方法。SpDamID是唯一能够识别与多个蛋白相互作用的DNA的方法，这通常是基因调控中的关键一步。

作者报道称，SpDamID可标记活细胞中的DNA，并且仅在两个标记的蛋白在相同的DNA链上彼此接近相互作用的情况下。该技术是基于先前的一种称为DamID的方法。Dam是一种酶（称为DNA腺嘌呤甲基化酶）的首字母缩写。

Hass和Kopan开发的方法，涉及到将Dam分裂为二，将一个功能性蛋白对半分为两个不活跃的部分。研究人员将这些不活跃的DAM部分与他们认为彼此靠近结合的蛋白连接起来，或者说，为了结合DNA，它们彼此之间是相互作用的。这使得Dam酶再次变得活跃起来，并标记染色体上两个蛋白相互作用的任何位置。

因为只有当两个蛋白是在同一个细胞中，并在同一段DNA上时，才会发生这个反应，因此，这无疑能够确定一对蛋白质的同步结合。此外，与ChIP-seq相比，该方法需要较少的细胞，从而可让研究过程持续的时间有限，或者发生在小的细胞群中。

在目前的研究中，为了证明SpDamID的能力，作者在小鼠肾祖细胞（Mk4细胞）中分析了Notch介导的的转录激活。自1990年以来，Notch——参与和大部分组织器官发育和维持的关键分子，一直都是Kopan实验室的焦点。这种分子的缺陷，在多种疾病中发挥核心作用，包括遗传性肾脏疾病（称为Alagille综合征）、肿瘤、CADASIL和多发性硬化症。

Hass称，他们开发出SpDamID，用以回答一些关于“Mk4细胞核中Notch转录调控”的重要问题。Notch是一种不直接与DNA结合的蛋白质。当Notch被打开时，它只在与一个DNA结合伴侣结合之后，才能结合DNA。反过来，Notch和它的合作伙伴可招募许多其他蛋白质，在几个关键位置打开转录。”

作者报告说，当DAM不活跃的那一半附着于Notch及其重新结合的伙伴时，它们会重新激活并标记肾细胞中的结合DNA。这让研究人员能够确定存在Notch的所有关键位置。此外，这些位点靠近另一个转录因子Runx1着陆的位点。作者用SpDamID表明，Notch和RUNX1在同一细胞内被结合到同一染色体上，用ChIP-seq他们不可能收集到这一证据。

Kopan和Hass表示，该技术将允许调查人员能够比较正常细胞和病变细胞中任何转录因子的结合，这可以提供“疾病引发因素”的新见解。

作者强调说，几乎每天都会报道新的研究技术，SpDamID对科学界的全面影响将在几年后得以评判。他们说，SpDamID的确为调查人员提供了一种工具，能够解决目前其他研究工具无法解决的问题。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：

SpDamID: Marking DNA Bound by Protein Complexes Identifies Notch-Dimer Responsive Enhancers
Summary: We developed Split DamID (SpDamID), a protein complementation version of DamID, to mark genomic DNA bound in vivo by interacting or juxtapositioned transcription factors. Inactive halves of DAM (DNA adenine methyltransferase) were fused to protein pairs to be queried. Either direct interaction between proteins or proximity enabled DAM reconstitution and methylation of adenine in GATC. Inducible SpDamID was used to analyze Notch-mediated transcriptional activation. We demonstrate that Notch complexes label RBP sites broadly across the genome and show that a subset of these complexes that recruit MAML and p300 undergo changes in chromatin accessibility in response to Notch signaling. SpDamID differentiates between monomeric and dimeric binding, thereby allowing for identification of half-site motifs used by Notch dimers. Motif enrichment of Notch enhancers coupled with SpDamID reveals co-targeting of regulatory sequences by Notch and Runx1. SpDamID represents a sensitive and powerful tool that enables dynamic analysis of combinatorial protein-DNA transactions at a genome-wide level.