单细胞组学：癌症研究的新工具

在过去十年中，借助新一代测序（NGS）平台，我们对癌症如何发展有了更深入的了解。众所周知，大多数大规模的癌症测序项目都以数百万个细胞为研究对象。尽管这提供了癌症变异的基本信息，但往往忽略或低估了单个癌细胞的异质性。如今，NGS技术的最新进展使人们能够分析肿瘤内单个细胞的基因组。

单细胞基因组学让临床医生和研究人员能够分离、分选并扩增细胞基因组，从而鉴定肿瘤内的细胞多样性，这种做法也逐渐成为精准医疗的一个内在要求。当然，对许多研究人员来说，这仍是一项很新的技术，它的普及还面临一些障碍。

“单细胞研究仍处于起步阶段，”Fluidigm的研究员Howard High指出。“因此，落实经费，建立实验，弄清楚如何管理和使用海量的数据、培养精通基因组学和细胞发育的研究人员，以及降低成本，这都是单细胞研究人员面临的一些挑战。”

单细胞分离

从字面上说，这个过程就是从实体瘤中解离细胞，并将它们分离，以便提取出细胞核DNA。听上去不难，但做起来不易。细胞彼此之间有很大的亲和力，不容易分开。而且，由于各种细胞表面分子的表达，许多肿瘤甚至更难分开。幸运的是，这些年来研究人员在拆解组织上已经很有经验，他们采用机械和化学的技术。

如今，人们主要采用两种方法来分离癌细胞中的遗传物质。第一种是利用荧光染料DAPI和流式细胞仪。通常，他们将冷冻的样品放入含有DAPI的细胞裂解液中，去除细胞膜，但保留核膜完整。随后，流式细胞仪根据倍体分离细胞。癌变的细胞要么含有太多的染色体或染色体片段（多倍体），要么太少（非整倍体）。

这种方法的主要缺点在于，无法获得转录组数据，因为那些遗传物质包含在细胞质中，而在加入裂解液后分散。第二种方法则解决了这些问题，使用微流体设备。由于便携性和成本低，这种设备在生物学研究中逐渐普及。

研究人员对肿瘤样品进行酶学处理，获得单细胞悬液，并在细胞分选平台上分类。这种技术与微流体设备相结合，不仅能够捕获单个细胞，还能利用反应小室来处理癌细胞的DNA或RNA。

新技术兴起

在单细胞基因组学研究开始之前，研究人员往往要权衡自己的选择，看看哪种方法能够带来最大收益。全基因组扩增（WGA）带来了每个肿瘤细胞的基因组数据，而利用适当的分析方法，可分析拷贝数或SNP数据。同时，RNA-Seq技术也被广泛使用。

近年来，科学家们开始绘制一幅更全面的图像。“单细胞表观基因组学才刚刚开始，而实质性的进展在不断涌现，”耶鲁大学遗传学系的科学家Xinghua Pan博士谈道。“单细胞染色质可接近性（sc-ATAC）分析现已报道，而全基因组或简化的亚硫酸氢盐测序（scRRBS、scWGBS）也已经降低到单细胞水平。

Pan博士自己的研究也是开创性的。他深入了解了CpG甲基化在正常和病变细胞中的作用，并开发出新技术，以便共同检测单细胞中的RNA和DNA。Pan博士相信，他的新方法能够促进癌细胞调控的研究，这是因为它们的异质性需要多维度的序列分析。

一些公司也为研究人员提供了单细胞平台。例如，Fluidigm最近推出了一款名为Polaris的单细胞系统。“这是一个单细胞研究系统，首次将细胞选择、分离、培养、给药和核酸样品制备整合为单个流程，从而使研究人员能够将基因表达和环境条件及表型信息直接关联，”High解释道。研究人员将能够在单个活细胞上开展剂量反应和时间进程研究。

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深入蛋白质组

当然，遗传物质最终将转化成细胞中的蛋白质。因此，许多研究人员将他们的注意力集中在单细胞蛋白质组学研究。近年来，研究界已经建立了一些方法，以鉴定蛋白的不同化学性质。尽管质谱分析（LC-MS）仍然是金标准方法，但这种技术需要投入大量的资金和精力，也不允许回收活细胞进行下游分析。

于是，单细胞蛋白质组学研究人员也在努力开发新的分析技术和设备。俄勒冈健康科学大学生物医学工程系的副教授Tania Vu博士正在开发一种技术。她希望“让我们能分析单细胞群体中的蛋白表达，并挑选出不同细胞间的差异，以及处理极少量的患者样本，而没有损失，这将实现许多不同种类的组合药物检测。”

Vu博士进一步解释道，这种技术可测定单细胞中的蛋白质含量变化，对单细胞蛋白质组学领域造成影响，这种技术的灵敏度极高，超过传统方法。对于了解单细胞亚群的差异而言，这是很重要的，因为这些差异可说明耐药性的潜在机制。

一些研究人员则是利用微流体设备以及芯片来形成小室，其中可加入一系列抗体来检测各种蛋白标志物。此外，还有一些研究人员采用微蚀刻技术来建立微型检测室，用于单细胞蛋白质组学分析。

无论采用何种方法，人们似乎都在拥抱单细胞组学的未来，并突破微型化分析的界限。这些单细胞方法正为了解癌细胞的进展提供前所未有的观点。

（作者：Jeffrey S. Buguliskis / 生物通编译）