诺奖得主和浙大学子Science发表重要技术突破

　　

生物通报道：霍华德·休斯医学研究所HHMI的研究团队在八月二十八日的Science杂志上发表了一项重要的技术突破。他们大大提升了结构照明显微技术（SIM）的空间分辨率，在活细胞中空前清晰地成像了动态的生物学过程。

诺贝尔奖得主Eric Betzig和华人博士后Dong Li在这项研究中，通过视频展示了细胞内结构蛋白的重塑，以及细胞摄入分子时的膜动态。Dong Li博士2006年毕业于浙江大学（本科），2011年在香港科技大学获得博士学位。

几个世纪以来，光学显微镜的“衍射极限”一直被认为是无法超越的。Eric Betzig、William Moerner 和Stefan Hell从不同途径突破了这一极限，并因此获得了2014年的诺贝尔化学奖。他们开发的超高分辨率显微技术，能够分辨距离少于200nm的两个物体。不过，目前超高分辨率显微技术在活细胞成像上还不那么实用。

“我们的新方法将超高分辨率技术真正带入到活细胞成像，”Betzig说。

目前主要的超高分辨率技术包括：光激活定位显微技术PALM、随机光学重建显微技术STORM、受激发射损耗STED，结构照明显微技术SIM和RESOLFT。SIM技术主要是通过特殊的照明模式（栅格移动）产生干涉图案（摩尔纹现象），这些干涉图案包含了样本的结构信息。随后计算机软件提取这些信息，并重建出三维的高分辨率图像。

Betzig指出，SIM一直不如PALM和STED受人关注，因为这两种技术的空间分辨率更为惊人。不过PALM和STED需要用到较多的光照，会使荧光标记快速褪色，样本也更容易受到破坏，难以进行长时间成像。而“SIM成像速度快，用到的光照也比较少，”Betzig说。

Betzig是在技术先驱Mats Gustafsson过世之后（2011年）着手SIM技术的。Gustafsson曾经改良过SIM成像的分辨率（saturated depletion non-linear SIM），他为此使用了更为严苛的条件，也损失了SIM的速度。现在，Betzig想办法解决了这一问题。

Gustafsson的改良主要是用光来控制荧光标记的开和关。先将所有的荧光标记激活并成像，然后用光失活这些荧光标记并再次成像，此时只有最暗的角落仍有分子在发光。研究显示，多次重复这一过程可以获得更为清晰的图像。

然而这一方法并不适合活细胞成像，Betzig指出。因为开关荧光分子太耗时间，反复光照也会损伤细胞和荧光标记。解决方法其实很简单，“启动所有分子是没有必要的，”Betzig说。他选择用特殊的光照模式启动荧光标记，然后用另一种光照模式关闭这些分子。最终Betzig将SIM成像的分辨率提高到了62nm。

“对于成像动态过程来说，如果成像速度没有相应的提升，光提高空间分辨率是没有意义的，”Betzig解释道。

研究人员开发的新技术（patterned photoactivation non-linear SIM）速度快而且效率高，其低强度光照保护了荧光标记，延长了成像时间，可以观察到更多的细胞活动。随后，他们又将这一技术与超高数值孔径（ultra-high numerical aperture）结合起来。超高数值孔径可以通过限制光照进一步减少细胞和荧光分子的损失，还可以同时成像多种颜色以追踪不同的蛋白。

研究人员用自己开发的技术生成视频，展现了细胞移动和改变形态时结构蛋白的解体和重组。他们还在细胞摄入外部分子的过程中，成像了网格蛋白包被的小窝。这项研究的定量分析回答了以往无法解决的问题，比如小窝的分布情况，以及小窝大小和寿命的关系。Betzig的研究团队正在尝试进一步改良SIM技术。他们还希望和其他研究者们合作，探索SIM技术的潜在应用，进一步加强这一技术的实用性。

对于研究细胞器或细胞膜的细胞生物学家而言，大多数需要检测的活动发生在低于200nm的水平上。近十年来，强大的新式显微镜让生物学们对生命背后的基础分子有了更为清晰的认识。而且随着超高分辨率显微技术的商业化，相信越来越多的科学家们将能从中获益。

在此之前Betzig还开发过一种新式成像平台，栅格激光层照显微镜（lattice light sheet microscope）。据介绍这一技术可以快速收集高分辨率图像，最小化对细胞的损伤，成像分子、细胞和胚胎的细微三维活动。已经有不少研究者使用过该技术，在一定时空范围内获得了多种生物学过程的视频，从单个蛋白的移动到整个胚胎的发育。（相关报道：Science封面：新科诺奖得主再发技术革新）

生物通编辑：叶予

生物通推荐原文：

Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics