巧妙利用SNP来实现CRISPR编辑

　　

生物通报道 众所周知，CRISPR/Cas9基因组编辑经过设计，可靶定基因组的各个部分，当向导RNA与PAM上游的序列匹配，这种技术会带来双链断裂。对于基因组编辑中常用的Cas9酶，PAM的序列通常是NGG。

不过，北爱尔兰阿尔斯特大学的研究人员发现，SNP可能会带来野生型等位基因中没有的PAM。假如SNP对应于一个有害的等位基因，那么所产生的PAM可能为基于编辑的基因治疗提供了一个切入点。这项成果于上周发表在《Nature Gene Therapy》上。

在这篇文章中，研究人员挑选出KRT12基因，其中一个显性失活SNP导致了Meesmann角膜营养不良。这是一种家族性的疾病，婴儿期起病，进展缓慢，青年期症状明显。特征为不透明物积聚在角膜。L132P突变将“AAG”序列改变为“AGG”，满足了化脓性链球菌Cas9的PAM要求。

尽管CRISPR/Cas9编辑可导致两个不同的修复机制，但作者表示，任何一个都会带来成功干预。非同源末端连接（NHEJ）将导致移码突变，阻止此基因表达，而通过野生型模板的同源性定向修复也能成功。“两种结果都能被认为是治疗成功，”作者写道，并表示KRT12等位基因的破坏似乎不影响角膜完整性。

研究人员发现，他们可以通过这个新颖的PAM实现基因编辑。在小鼠模型中，他们证明了等位基因的体内编辑，其中13只小鼠中的5只测序后发现18至53个核苷酸的缺失。尽管这项研究主要集中在L132P突变，但作者认为许多SNP可创建新的PAM。

“显性失活错义突变可能导致一系列不同的角膜营养不良，我们的分析表明，高达三分之一的突变带来了新颖的PAM位点，这有望被CRISPR技术所使用，”文章的通讯作者之一、阿尔斯特大学的Andrew Nesbit谈道。

这种方法可能也适用于角膜营养不良以外的疾病。“对于一系列杂合的致病SNP，开发疗法的潜力存在，不管是利用NHEJ敲除突变等位基因，还是利用HDR修复突变等位基因，”作者写道。（生物通 薄荷）

原文检索

CRISPR/Cas9 DNA cleavage at SNP-derived PAM enables both in vitro and in vivo KRT12 mutation-specific targeting

Gene Therapy 20 August 2015; doi: 10.1038/gt.2015.82