专家指南：CRISPR实验中如何验证编辑[创新技巧]

在CRISPR/Cas9基因组编辑实验中，如果你已经构建好了gRNA表达载体，并利用Cas9将它引入了目标细胞，那么恭喜你！成功就在眼前，指日可待。下一步，你还要验证一下，看看细胞的编辑是否如你所愿。在此，一些专家给你提了一些建议。

验证的方法将因物种和编辑类型而异。在这里，我们主要关注二倍体的哺乳动物细胞，不过许多原理也同样适用于其他的模式生物。

在细胞中引入Cas9和gRNA，将带来混合的细胞群体。双链断裂（DSB）产生之后，细胞内的修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）来起作用。哺乳动物细胞的修复以NHEJ为主，这就带来了插入缺失的错误。不过引入的插入缺失存在异质性，而等位基因编辑的频率也有所不同。有的细胞没有被编辑，有的只有一个等位基因被编辑，而有的则有两个。同源定向修复则需要修复模板的存在。

验证过程的第一步是快速评估是否有一定量的细胞被编辑。对于插入缺失而言，可通过错配切割分析来观察。对于HDR，往往可通过限制图谱的改变或报告基因的读数来观察。对于缺失，你可以通过特殊设计的PCR引物来判断。

一旦你知道有一部分细胞经过了编辑，那么你可以继续创建克隆细胞系。利用连续稀释，来分离单个细胞，接着进行扩增产生细胞系。如果你的质粒上有荧光蛋白的标记，那么可通过FACS来富集含有Cas9和gRNA的细胞。扩增后，分析每个细胞系，并测序目的区域，以验证编辑是否如你所愿。如果可能，你还可以开展western blot。

错配切割分析

错配切割分析是一种快速而简单的插入缺失检测方法。此过程中通常使用Surveyor核酸酶，因为它切割DNA双链3’端的任何错配。它能够检测多达12个核苷酸的插入缺失，对频率低至1/32的突变敏感。

此分析通常包含四个步骤：1. PCR扩增目标区域；2. 变性并再次杂交，让突变型和野生型的链退火；3. 用Surveyor核酸酶处理退火的DNA，以切割异源双链；4. 琼脂糖凝胶电泳分析DNA。在这个例子中，两个+gRNA的泳道都包含了预期大小的片段，表明gRNA成功产生了插入缺失。这种分析通常是半定量的，你可以看出gRNA1似乎比gRNA2更有效。

（图片来自Addgene）

检测同源定向修复

如果你希望利用HDR来实现突变，那么你最好先确定gRNA是否能高效切开你的目标序列。这可以参考上面的错配切割分析。一旦你选择了最佳的gRNA，就可以引入它和Cas9以及你的修复模板。

在设计你的HDR修复模板时，事先要计划好整合事件的检测。举个例子，你需要有目的地引入或删除限制性酶切位点，这会改变PCR产物的酶切。或者，你加入一个报告元件，以便在DNA、RNA或蛋白水平检测HDR。如果整合了大的插入或缺失，那么也可通过PCR产物的大小变化来检测。如果单核苷酸的变化引入或删除了限制性酶切位点，那么可通过酶切来快速判断。否则，只能通过Sanger测序、新一代测序或数字PCR来检测。

HDR事件的频率往往不及插入缺失，因此你可能需要筛选比较多的克隆。这个具体数量要取决于你的转染效率和HDR频率。如果你的转染效率是40%，而HDR频率是5%，那么2%的细胞将产生重组区域。因此，你至少要筛选50个克隆。如果你能够利用标记选择出成功转染的细胞，那么筛选的数量就能大大减少。

通过PCR来检测缺失

大多数的缺失是利用两个gRNA来创建的，它们指导Cas9来切割DNA的中间区域。因此，缺失可以通过PCR来检测，扩增时使用在缺失区域两侧的引物。在这个例子中，我们可以看出，克隆1、5和7是缺失的杂合子，而克隆4是缺失的纯合子。

新一代测序也是个选择

当然，如果你的实验室有资源，你也能利用新一代测序（NGS）来定量评估基因组编辑。当你有大量的样品，或希望同时检测脱靶效应，那么NGS是个好的选择。在使用这种方法时，你需要有一组对照细胞，这样你才能比较编辑前和编辑后样品的测序读取。CRISPResso等软件能帮助你开展数据分析。

值得一提的是，这篇文章中的方法并不是只针对CRISPR的，同样适用于TALEN或锌指核酸酶的编辑。无论你采用什么方法，验证编辑的时间都是值得花的。磨刀不误砍柴工！

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如果你还有疑问，可以读一读下面这两篇文献。

Mutation detection using Surveyor nuclease. Qiu P, Shandilya H, D'Alessio JM, O'Connor K, Durocher J, Gerard GF. Biotechniques 2004 Apr; 36(4):702-7.

Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Nature Protocols. 2013 Nov; 8(11):2281-2308.

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