基于PCR评估sgRNA特异性的方法

　　

生物通报道：CRISPR/Cas9已经成为一种通用的基因组工程工具，依赖于一个单导向RNA（sgRNA）和Cas9酶进行基因组编辑。研究人员可以用简单、快速和经济的方法来产生sgRNAs，因此能够在培养细胞、小鼠、斑马鱼和其他模型系统中进行靶向诱变。为了靶向效率，预先筛选sgRNAs，对于成功诱变和减少动物饲养成本，都是可取的。八月七日在国际学术期刊《Nucleic Acids Research》发表的一项研究中，来自美国国立卫生研究院的研究人员，提出了一种简单、快速和具有成本效益的荧光PCR为基础的方法——CRISPR Somatic Tissue Activity Test (CRISPR-STAT)，来确定sgRNA的靶向特异性效率。

最近，利用锌指核酸酶（ZFNs）、TAL效应物核酸酶（TALENs）和CRISPRs进行基因组编辑所取得的进展，已经使人们有可能在许多系统（包括斑马鱼）中进行靶向诱变。而靶向特异性的ZFNs和TALENs组装，由于设计、成本的限制和/或繁琐的程序，具有很多局限性，CRISPR/Cas9需要设计一个引导RNA（sgRNA），可以很低的成本快速地合成。延伸阅读：检测CRISPR/Cas9脱靶效应的简单方法。

此外，CRISPR/Cas9的靶序列是灵活的，仅仅受到一个protospacer相邻基序（PAM位点）的需要的限制。因此，快速设计和生成多个靶标的sgRNAs是简单的。然而，所有的sgRNAs在产生靶位点突变的时候，并没有表现出类似的活性水平。通过计算方法预测活性，对于所有应用程序可能是不可靠的，因为标准是来自于有限的、背景特定的数据。因此，对任何给定sgRNA活性水平进行快速的实验验证，是必不可少的。

目前，已经开发了许多方法来评估靶向核酸酶（包括CRISPR/Cas9）的活性。确定体细胞活性水平的“金标准”方法，是通过对靶区域进行PCR，然后对大量克隆进行测序。虽然这种方法在确定活性水平方面，具有很高的灵敏度和特异性，但是它是昂贵的，并且是劳动密集型的。简单的错配试验，如高分辨率熔解分析（HRMA）和DNA裂解（通过T7核酸内切酶），在某些生物（如斑马鱼）中具有很差的特异性，基因组中具有高频的多态性，可造成假阳性的结果。

同样，限制性片段长度多态性分析受到靶位点选择的限制。Yu等人开发的基于定量PCR反应的程序，是检测体细胞活性的一种可行方法。然而，我们可能很难设计与预测切割位点重叠的稳定引物。最近两种以序列为基础的方法——称为TIDE和CRISPR-GA，被用于细胞培养实验中sgRNA活性的定量评价。然而，这两种方法都有其应用的局限性。目前还没有任何一种检测，可以很容易地用于所有模型系统。

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在这项研究中，研究人员证明了CRISPR-STAT在斑马鱼中用作预筛选方法来评估sgRNA特异性的效用。通过将CRISPR-STAT评估与产生sgRNA的的无克隆方法相结合，任何实验室应该都可以在感兴趣的基因中产生突变，并在饲养动物之前确证打靶的有效性。研究人员建议，每个基因应该设计至少两个sgRNA，并评估一小部分的注射胚胎。这种方法有利于成功的诱变，并最大限度地减少了动物饲养和首建动物筛选的时间和成本。

作为原理验证，研究人员在斑马鱼中检测了这种方法，他们用具有已知和不同种系传递效率的28个sgRNA，分析了它们在注射胚胎中的体细胞活性。这些数据显示，在注射胚胎的荧光PCR分析结果和种系传递效率之间，存在着强烈的正相关性。此外，这种方法非常敏感，足以评估多个基因打靶。虽然，该研究是利用CRISPR/Cas9和斑马鱼测试了这种方法，但是它也可以应用于其他动物模型系统，以及其他基因组靶向核酸酶。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
CRISPR-STAT: an easy and reliable PCR-based method to evaluate target-specific sgRNA activity.
Abstract: CRISPR/Cas9 has emerged as a versatile genome-engineering tool that relies on a single guide RNA (sgRNA) and the Cas9 enzyme for genome editing. Simple, fast and economical methods to generate sgRNAs have made targeted mutagenesis routine in cultured cells, mice, zebrafish and other model systems. Pre-screening of sgRNAs for target efficacy is desirable both for successful mutagenesis and minimizing wasted animal husbandry on targets with poor activity. Here, we describe an easy, quick and cost-effective fluorescent polymerase chain reaction (PCR)-based method, CRISPR Somatic Tissue Activity Test (CRISPR-STAT), to determine target-specific efficiency of sgRNA. As a proof of principle, we validated our method using 28 sgRNAs with known and varied levels of germline transmission efficiency in zebrafish by analysis of their somatic activity in injected embryos. Our data revealed a strong positive correlation between the fluorescent PCR profiles of the injected embryos and the germline transmission efficiency. Furthermore, the assay was sensitive enough to evaluate multiplex gene targeting. This method is easy to implement by laboratories with access to a capillary sequencer. Although we validated the method using CRISPR/Cas9 and zebrafish, it can be applied to other model systems and other genome targeting nucleases.