张素春教授Cell stem cell：用CRISPR构建诱导性基因敲除人类干细胞系

　　

生物通报道  来自威斯康星大学的研究人员报告称，他们开发出了一种新策略来快速构建诱导性基因敲除（iKO）人类多能干细胞（hPSC）系。相关研究论文发布在7月2日的《细胞干细胞》（Cell stem cell）杂志上

威斯康星大学的张素春（Su-Chun Zhang）教授及助理研究员Yuejun Chen是这篇论文的共同通讯作者。张素春教授是著名的WiCell研究所创始人之一。他的实验室主要研究胚胎干细胞（尤其是人胚胎干细胞）的神经分化，是该领域做的最好的实验室。他的贡献包括曾在国际上首次将人胚胎干细胞分化成神经前体细胞，将胚胎干细胞分化成各种类型神经元及胶质细胞，研究关键基因（如Pax6等）在神经系统发育中的作用等。

hPSCs（包括胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞(hiPSCs)），具有生成机体内所有的细胞类型。因而当前被人们广泛地用于构建基于细胞的体外疾病模型，化学筛查和细胞治疗。然而直到现在，构建出可诱导基因敲除的hPSC细胞系仍然是一个极大的挑战。

CRISPR/Cas9系统是近年来兴起的一种强大的基因组编辑工具，这一系统是通过细菌的II型规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)序列和它自身一种非常高效的Cas9核酸酶，来靶向目的基因造成特异的双链断裂(DSBs)而有效地引起基因组改变或突变。目前,CRISPR/Cas9系统已被用于hESCs和hiPSCs的基因修饰稳定株的制备,还用于大鼠,线虫,斑马鱼等基因敲除动物模型的构建（延伸阅读：CRISPR先驱Science发表新成果 ）。

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条件性基因敲除/敲入是指在特定的组织或细胞发育的特定阶段敲除或敲入某一特定的基因，对于研究特定基因在特定组织及特定时间的功能具有重要意义。当前研究人员主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现条件性基因敲除或敲入。这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。

在这篇Cell stem cell文章中，张素春教授和他的研究小组探讨了联合CRISPR/Cas9介导的基因组编辑和Flp/FRT及Cre/LoxP系统来构建iKO hPSC细胞系。他们发现“双sgRNA寻靶”是实现FRT精确双等位基因敲入的必要条件。他们进一步开发了一种策略，可在插入一种活性可控的表达重组酶的基因盒（cassette）的同时除去耐药基因，由此加快了生成iKO hPSC细胞系的速度。研究人员利用这种两步策略构建出了SOX2、PAX6、OTX2和AGO2诱导性基因敲除的hESC和iPSC细胞系。

作者们表示，利用这种新策略来获得iKO hPSC细胞系，将大大改变我们在人类细胞中探究基因功能的方式。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Engineering Human Stem Cell Lines with Inducible Gene Knockout using CRISPR/Cas9

Precise temporal control of gene expression or deletion is critical for elucidating gene function in biological systems. However, the establishment of human pluripotent stem cell (hPSC) lines with inducible gene knockout (iKO) remains challenging. We explored building iKO hPSC lines by combining CRISPR/Cas9-mediated genome editing with the Flp/FRT and Cre/LoxP system. We found that “dual-sgRNA targeting” is essential for biallelic knockin of FRT sequences to flank the exon. We further developed a strategy to simultaneously insert an activity-controllable recombinase-expressing cassette and remove the drug-resistance gene, thus speeding up the generation of iKO hPSC lines. This two-step strategy was used to establish human embryonic stem cell (hESC) and induced pluripotent stem cell (iPSC) lines with iKO of SOX2, PAX6, OTX2, and AGO2, genes that exhibit diverse structural layout and temporal expression patterns. The availability of iKO hPSC lines will substantially transform the way we examine gene function in human cells.