检测CRISPR/Cas9脱靶效应的简单方法

CRISPR/Cas系统目前被广泛应用于各种研究中，而将来更有望用于临床，但脱靶效应的存在始终是个问题。七月二十四日，来自意大利的研究人员，提出了一种基于荧光原位杂交（FISH）的简单策略，可让我们对一个给定质粒的非特异性整合进行检测和频率评估，相关研究结果发表在Nature旗下子刊《Scientific Reports》。

　　

生物通报道：CRISPR/Cas系统目前被广泛应用于各种研究中，而将来更有望用于临床，但脱靶效应的存在始终是个问题。七月二十四日，来自意大利国家研究委员会（Consiglio Nazionale delle Ricerche）和意大利人类临床和研究中心的研究人员，提出了一种基于荧光原位杂交（FISH）的简单策略，可让我们对一个给定质粒的非特异性整合进行检测和频率评估，相关研究结果发表在Nature旗下子刊《Scientific Reports》。

CRISPR/Cas9系统是一种创新、特异而有效的基因编辑方法。然而，它应用于人类研究，还需要进一步调查其他基因位点的额外修饰（所谓的“脱靶”事件）。目前，科学家们已经使用了几种方法，来尽量减少脱靶事件的程度，并验证脱靶的非特异性切割。延伸阅读：检测CRISPR/Cas9基因编辑系统的副作用。

当前，检测打靶和脱靶事件的程序包括，使用能够识别双链DNA不匹配的核酸酶来分析细胞库（DNA体外裂解实验），通常是在一个癌细胞株中进行的。如果选择的单导向RNA（sgRNA）在这个分析中正常运行，这个程序就能在所需的细胞上重复，并且通过相关区域的扩增和测序，鉴定靶向的同基因克隆。这些步骤可让我们识别具有预期修饰的克隆。然而，这样更难以排除脱靶事件：为此，研究人员通过软件扫描整个基因组，寻找序列的相似性，分析假定的脱靶效应，并对假定的位点进行扩增和测序。

即使在这种情况下，通过软件工具仍不能确定脱靶效应，除非对双亲和修饰克隆进行全基因组测序（WGS）。最近发表的两篇论文，报道了在靶向多能干细胞克隆中进行全基因组测序所获得的结果，表现出较低频率的脱靶事件。然而，这种方法是昂贵和耗时的。因此，迫切需要一种程序，能够快速识别打靶和脱靶效应的相对频率，从而有助于初始阶段的分析，可让我们消除打靶/脱靶事件比率较低的候选克隆。

这项研究表明，荧光原位杂交（FISH）——广泛用于诊断和基因组研究的一种细胞遗传学技术，是检测CRISPR/Cas9基因编辑结果的很好工具。该方法可以应用于基因编辑分析的初始步骤，可以直接在靶细胞系上进行。FISH分析表明，一个给定质粒的非特异性整合与软件预测的脱靶位点不匹配。研究人员推断，这些CRISPR介导的脱靶DNA切割的频率是可以忽略不计的，因为，由于自发性双链断裂的出现，研究人员观察到了更多的非特异性质粒整合。

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作者认为，这种分析代表了一种很有前途的方法，可对候选RNA导向行为获得快速的评估，能评估脱靶事件，并鉴定在选择位点之外有额外插入的克隆，包括通过序列相似性预测不到的脱靶事件。作者建议，在候选sgRNA引导的初步评估中使用这种细胞遗传学方法，将会减少晚期寻找最佳基因组序列所付出的时间和精力。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
A pre-screening FISH-based method to detect CRISPR/Cas9 off-targets in mouse embryonic stem cells
Abstract: The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/associated 9 (Cas9) technology has been recently added to the tools allowing efficient and easy DNA targeting, representing a very promising approach to gene engineering. Using the CRISPR/Cas9 system we have driven the integration of exogenous DNA sequences to the X-linked Hprt gene of mouse embryonic stem cells. We show here that a simple fluorescence in situ hybridization (FISH)-based strategy allows the detection and the frequency evaluation of non-specific integrations of a given plasmid. FISH analysis revealed that these integrations do not match the software predicted off-target loci. We conclude that the frequency of these CRISPR-mediated off-target DNA cuts is negligible, since, due to the occurrence of spontaneous double-strand breaks, we observed more aspecific plasmid integrations than those corresponding to predicted off-target sites.