天生一对：CRISPR/Cas9与AAV

CRISPR/Cas9已经成为体外基因组编辑的最流行系统，但体内的基因编辑方法仍然受到Cas9导入问题的限制。腺相关病毒载体（AAV）因免疫原性低而常常用于基因的体内导入。不过，化脓链球菌（spCas9）和嵌合sgRNA（总共~4.2 kb）要包装到AAV载体中还蛮有挑战性的，因为AAV只能容纳~4.5 kb。尽管这种方法已被证明是可行的，但留给其他调控元件的位置也不多了。之前，张锋研究组将Cas9和多个gRNA包装到AAV载体中，提高了整体的包装能力，但必须纯化和共感染两个AAV。

为了最大限度提高AAV的能力，Gang Bao的研究小组开发出一种分裂内含肽的Cas9，它可分在两个AAV表达框中，将更多空间留给调控序列和gRNA。不过，为了让Cas9和gRNA在一起，这个构建体必须更小。之前的尝试是使用来自嗜热链球菌的St1Cas9（~3.3 kb）和截短的Cas9。不过它们都有一些缺点：St1Cas9需要非常特异的PAM序列，限制了可靶定位点的数量，而截短的Cas9则效率要低得多。

张锋研究组的Fei Ann Ran等最近也开发出一种新的策略来克服这些缺陷。为了发现更短、但同样有效的Cas9酶，他们分析了600多个Cas9的直系同源物，并发现这些分为两类：一类大约有着1350个氨基酸，包括SpCas9，而另一类则有着约1000个氨基酸。在那些较短的同源物中，只有金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）在哺乳动物细胞中表现出切割活性。SaCas9产生插入/缺失，效率与SpCas9相似，这使得研究小组把精力都集中在SaCas9的研究上。

CRISPR/Cas9基因组编辑的另一个缺陷是可能发生脱靶效应。为了比较SpCas9和SaCas9的脱靶效应，研究人员使用了一种称为BLESS的方法。利用这种灵敏的方法，他们发现SaCas9并没有表现出比SpCas9更高的脱靶活性，确认它适合体内研究。

为了检验AAV-SaCas9在体内的效率，Ran等人利用肝特异的血清型AAV8创建了一个all-in-one的SaCas9和sgRNA构建体。由于CRISPR/Cas9的基因编辑效率随目标而异，他们检验了小鼠中的两个基因。对于这两个基因，他们在注射1周后都观察到插入/缺失的形成和表型的变化。小鼠肝脏在组织学上表现正常，与AAV-GFP对照相比，肝损伤标志物也没有增加。AAV-SaCas9-sgRNA不仅介导了基因组修饰，也没有引起明显的免疫应答。

今年4月，研究小组在《Nature》杂志上展示了他们的成果。张锋表示：“我们的长期目标是将CRISPR开发为一种治疗平台。这种新的Cas9为扩大我们的Cas9清单，帮助我们构建出更好的疾病模型，鉴别出一些机制，以及开发出新疗法提供了一个支架。”（生物通 薄荷）

参考文献

In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem O, Wu X, Makarova KS, Koonin EV, Sharp PA, Zhang F. Nature. 2015 Apr 9;520(7546);186-91. doi: 10.1038/nature14299. Epub 2015 Apr 1.