潘滔教授Nature Methods发布RNA测序重大突破

　　

生物通报道  来自芝加哥大学、德克萨斯大学奥斯汀分校的研究人员报告称，他们开发出了一种新方法实现高效定量高通量tRNA测序。这种叫做DM-tRNA-seq的技术适用于在所有生物体中开展tRNA研究。这一重要的研究成果发布在7月27日的《自然方法》（Nature Methods）杂志上。

芝加哥大学生物化学和分子生物学教授潘滔（Tao Pan）博士及德克萨斯大学奥斯汀分校的Alan M Lambowitz是这篇论文的共同通讯作者。芝加哥大学的何川（Chuan He）教授是这篇论文的合著作者之一。

转录组是特定细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA的集合。通过对转录组的研究可以揭示生物体的基因表达，研究结构变异及发现新基因。RNA测序(RNA-seq)作为一种新的转录组研究手段，利用新一代测序技术能够更快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息。

广泛使用的RNA-seq是通过提取样本总RNA后，根据所测RNA种类进行分离纯化。在进而片段化为所用测序平台所需的长度（或反转录后片段化），反转录后连接测序接头。接着利用PCR扩增达到一定丰度上机测序，直到获得足够的序列。所得序列通过与参考基因组比对或从头组装形成全基因组范围的转录组。

这种标准方法适用于诸如mRNA、长链非编码RNA、miRNA或来自rRNA的片段、小核RNA及小核仁RNA等大多数的细胞RNAs。tRNA是唯一一类无法有效及定量应用标准测序方法的细胞小RNA分子。测序tRNA的主要障碍包括tRNA中存在很多的转录后修饰，以及它稳定和广泛的二级结构，这些干扰了cDNA合成和接头连接。

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tRNAs对于细胞极为重要，tRNAs的合成受到严格的细胞控制。近期的一些研究证据表明，tRNA表达和突变与诸如神经系统疾病和癌症等各种疾病有着关联。缺乏有效及定量tRNA测序方法阻碍了对tRNA的生物学研究。

在这篇Nature Methods文章中，研究人员开发出了DM-tRNA-seq的测序技术，采用两种策略消除或大大减少了tRNA修饰和结构障碍。第一个是，采用来自大肠杆菌野生型酶AlkB和特异突变体D135S AlkB的酶混合物去除了人类tRNA中的三种DNA甲基化：N3-甲基胞嘧啶（m3C）、N1-甲基胞嘧啶（m1C）和N1-甲基鸟苷（m1G）。第二种策略，是利用耐热II组内含子逆转录酶(TGIRT; InGex)持续合成了来自高度结构化tRNA的cDNA。由此，采用这些策略研究人员在HEK293T细胞中实现了高效的定量tRNA测序。

作者们指出，新的DM-tRNA-seq测序方法不仅使得进行高效定量tRNA测序变得切实可行，并能够以一种高通量的方式用于研究tRNA上的这些甲基化修饰。

此外，不久前潘滔教授课题组还发布了另一项重要的研究发现，证实一些mRNA上的表观遗传修饰充当了结构“开关”：通过物理上开放折叠mRNA链中的空间，使得RNA结合蛋白能够识别及读取其他方式无法接近的mRNA区域，由此揭示出了基因表达另一层次的表观遗传调控机制。这一研究成果发布在Nature杂志上（延伸阅读：潘滔教授Nature揭示重要表观遗传开关 ）。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing

Despite its biological importance, tRNA has not been adequately sequenced by standard methods because of its abundant post-transcriptional modifications and stable structure, which interfere with cDNA synthesis. We achieved efficient and quantitative tRNA sequencing in HEK293T cells by using engineered demethylases to remove base methylations and a highly processive thermostable group II intron reverse transcriptase to overcome these obstacles. Our method, DM-tRNA-seq, should be applicable to investigations of tRNA in all organisms.