Cell：利用CRISPR-Cas9绘制广泛天然免疫网络图谱

　　

生物通报道  来自哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人员将CRISPR-Cas9筛查技术应用于小鼠骨髓源性树突状细胞，研究了PAMPs触发的免疫反应的调控机制。通过综合分析基因敲除结果及蛋白质和mRNA表达改变，他们利用CRISPR筛查以前所未有的分辨率剖析了免疫调控网络。这一重要的成果发布在7月16日的《细胞》（Cell）杂志上。

上接：张锋参与Cell发布CRISPR重要新成果

随后，研究人员基于它们对树突状细胞功能选择性标记物RNA和蛋白质表达的影响，对所有已知和新鉴别出的调控因子进行了赋值。除了已知的TLR信号调控因子，还鉴别出了由从前未发现与TNF调控或炎症基因表达相关的一些基因组成的两个组件：一个是OST蛋白质糖基化复合物和内质网（ER）折叠及易位信号通路；另一个是参与了转录延伸调控的PAF复合物。尽管尚不清楚OST和PAF复合物是如何在分子水平上影响TLR信号通路的，这一研究表明了需要无偏倚地去探查功能网络以了解细胞内一些生物学功能的关联。

哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人员所开展的CRISPR筛查其中一个新颖之处在于，他们将这一技术应用于原代细胞研究了与传染病相关的免疫信号。近期一项类似的研究报告称利用全基因组RNA干扰筛查，揭示出了由病原相关分子模式(PAMPs)触发的天然免疫信号。

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在这项Cell研究中，作者们报告称发现了一个新的PAMP，并检测出了一些TRAF复合物组件，但这一筛查还远未达饱和。CRISPR-Cas9技术有潜力在哺乳动物细胞中实现饱和遗传筛查，使得能够解译出几近完整的分子信号通路。

研究人员结合CRISPR筛查和细胞分选，还揭示出了一些特殊蛋白质或细胞增殖之外一些生物表型的调控因子。这一方法可以适用于广泛的靶标，并有着巨大的潜力用于鉴别未确定特征的调控网络。

当我们学习将这一不可思议的技术应用于遗传筛查时，不应该忘记CRISPR-Cas9系统还有一些潜在的缺陷：例如，在进行全基因组筛查时，应考虑到由于低文库覆盖度或脱靶效应导致检测出一些假阳性和假阴性靶蛋白。

在这篇Cell文章中，研究人员采用一些策略：根据适当的阳性对照例如基因本体注释及一组参考必需和非必需基因来评估筛查性能，并测量初次筛查击中蛋白的频率有效地解决了这些问题。通过更深入的二次筛查研究人员减少了相比于全基因组文库的大小，有限的细胞数量造成的假阴性。

作者们指出，全基因组CRISPR筛查已经开始彻底地改变对调控网络的研究，并打开了通往系统层面上一些新研究发现的大门。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks

Finding the components of cellular circuits and determining their functions systematically remains a major challenge in mammalian cells. Here, we introduced genome-wide pooled CRISPR-Cas9 libraries into dendritic cells (DCs) to identify genes that control the induction of tumor necrosis factor (Tnf) by bacterial lipopolysaccharide (LPS), a key process in the host response to pathogens, mediated by the Tlr4 pathway. We found many of the known regulators of Tlr4 signaling, as well as dozens of previously unknown candidates that we validated. By measuring protein markers and mRNA profiles in DCs that are deficient in known or candidate genes, we classified the genes into three functional modules with distinct effects on the canonical responses to LPS and highlighted functions for the PAF complex and oligosaccharyltransferase (OST) complex. Our findings uncover new facets of innate immune circuits in primary cells and provide a genetic approach for dissection of mammalian cell circuits.