卢冠达博士：用CRISPR揭示非编码RNA的秘密

　　生物通报道：非编码RNA（ncRNA）是指不编码蛋白质的RNA。从上世纪六十年代的tRNA、八十年代的rRNA、到九十年代的microRNA，非编码RNA在不断给人们带来惊喜。科学家们也逐渐意识到非编码RNA并不是基因组中的垃圾序列，而是许多基础生命过程的核心，有着广泛的生物学功能。

真核生物的非编码RNA广泛参与了关键性细胞功能的调控。随着测序技术的飞速发展，研究者们发现了越来越多的新型非编码RNA，比如lncRNA、环状RNA、piRNA等等。非编码RNA的丰度、保守性、结构和功能多样性，不仅丰富了我们的细胞生物学知识，还挑战了我们一直以来对真核生物基因组的认识。

目前许多非编码RNA的具体功能和作用机制还鲜为人知。美国麻省理工的副教授卢冠达(Timothy Lu)在七月十六日的Molecular Cell杂志上发表文章，阐述了一项最新技术在非编码RNA研究领域的应用前景。卢冠达(Timothy Lu)博士是生物工程、电子工程及计算机科学系的副教授，这位青年科学家曾被麻省理工的百年期刊《技术评论》评为世界青年科技创新家。

这篇文章介绍了一个以CRISPR-Cas9为基础的基因组靶向技术，CRISPR-Display (CRISP-Disp)。这一技术是John Rinn博士开发的，能将大片段的非编码RNA送到指定基因组位点。Rinn博士曾被评为2009年美国国内撼动科学界的青年英才，是RNA领域的著名青年科学家。（相关报道：Nature子刊开发CRISPR系统新功用）

细菌一直在与病毒或入侵核酸进行斗争，为此它们演化出了多种防御机制，CRISPR/Cas适应性免疫系统就是其中之一。规律成簇的间隔短回文重复CRISPR与内切酶Cas9的组合，可以在引导RNA的指引下，靶标并切割入侵者的遗传物质。

2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。该系统使用简单而且扩展性强，很快便成为了生物学领域的香饽饽。2015年基因组编辑热潮在持续发酵，CRISPR/Cas9仍旧是最引人注目的话题之一，相关论文被大量下载和引用。

在CRISP-Disp系统中，失去催化活性的dCas9作为可编程的DNA结合蛋白，其特异性由引导RNA（gRNA）决定，gRNA上融合有异源的效应结构域。研究人员摸索出的gRNA-ncRNA融合方法，能将非编码RNA带到特定DNA位点，同时不影响dCas9的功能和活性。卢冠达(Timothy Lu)认为，这个系统在合成生物学和非编码RNA机理研究中具有非常大的应用潜力。

对合成生物学研究者来说，CRISP-Disp的灵活性、模块化和多重化特性是很有吸引力的。据介绍，CRISP-Disp系统可以容纳约4.8 kb的RNA结构域，这相当于天然lncRNA的长度。除了lncRNA以外，研究人员还对各种天然和人工非编码RNA进行了测试。研究表明，gRNA可以偶联多个非编码RNA结构域，这些结构域可以同时且独立的起作用。用CRISP-Disp招募RNA-蛋白复合体到特定位点，可以设计出复杂的基因调控回路。

除了合成生物学应用，CRISP-Disp还是一个研究非编码RNA功能的强大工具，包括近来备受关注的lncRNA。尽管人们为了理解lncRNA的功能和作用机制已经做出了很多努力，但能够全面靶标和分析lncRNA的平台并不多，还有很多问题没有得到解答。举例来说，一个lncRNA片段是如何激活基因表达的？是这个片段的转录本在起作用，还是它本身的序列在起作用？CRISP-Disp可以用来解决这个问题，揭示lncRNA在表观遗传学修饰、染色质重塑或者转录调控中做出的贡献。

还有一些非编码RNA也涉及了基因表达的激活。举例来说，在很多情况下基因表达需要增强子区域转录的RNA（eRNA）。然而，我们至今还不清楚eRNA究竟是如何起作用的，比如它可能改变DNA的拓扑结构，让增强子和启动子靠近。如果eRNA的激活功能是其序列的内在特性，那么将它添加到CRISP-Disp系统中就可以活化指定位置的任何基因。但就目前的研究结果来看，eRNA并没有在这个体系中起到强力的基因激活作用。这些结果支持了之前人们提出的假说，该假说认为eRNA可能是基因座特异性增强子复合体中的一个元件。

文章指出，目前CRISP-Disp还需要进一步测试，明确它用于各种人工和天然非编码RNA时的局限。这一技术将成为一个广泛适用的研究工具，帮助人们将非编码RNA带到特定的基因组位点，在那里实现各种各样的功能。

 

生物通编辑：叶予

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Multiplexable, locus-specific targeting of long RNAs with CRISPR-Display