我科学家用CRISPR实现大豆定向诱变

　　

生物通报道：自CRISPR热潮开始以来，科学家们就一直专注于改变系统精确而可靠的DNA切割，使其适用于遗传改造。2015年五月二十九日在Nature子刊《Scientific Reports》发表的一项研究中，来自西北农林科技大学、中国农科院作物研究所和天津农科院的研究人员，利用CRISPR-Cas9系统，在大豆作物中成功实现了定向诱变。定向基因突变的高效率，可以改善大豆基因功能的研究。延伸阅读：西北农林PNAS利用TALEN技术获抗结核转基因牛。

西北农林大学农学院的奚亚军教授是本文通讯作者，奚亚军教授早年毕业于西北农业大学，同年留校从事教学和科研工作，1999年获西北农业大学硕士学位，2002年获西北农林科技大学农学博士学位，2000年至2001年在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室从事客座研究。2006-2007年在美国诺贝尔基金会的分子生物学实验室进行合作研究。主要从事小麦和生物能源作物柳枝稷的基因工程研究。近年来先后主持多项基金项目，获部省级奖励2项，国家发明专利2件，参与育成小麦品种1个。以第一作者或通讯作者在《Bioenerg Res》、《Euphytica》、《Methods Mol Biol》、《中国农业科学》、《作物学报》等刊物上发表论文30余篇。中国农科院作物研究所的胡正是本文另一位共同通讯作者。

基因组编辑是分析基因功能、基因治疗与作物改良的重要工具。近年来，已经开发出三种基因组编辑技术，分别依靠锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样核酸酶（TALENs）和集群定期间隔短回文重复（CRISPR）/ CRISPR相关蛋白（Cas）系统。所有这三种方法都可诱导靶基因组DNA中的双链断裂（DSBs），然后通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）进行修复。ZFNs和TALENs可过蛋白质与DNA之间的相互作用，靶定基因组，而通过CRISPR-Cas系统的基因组DNA编辑，是基于短的RNA-DNA碱基配对。与ZFNs和TALENs相比，用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑更简单、更快和更有效。因此，在过去两年里，CRISPR-Cas系统已被广泛应用于真核细胞的基因组编辑。延伸阅读：Science综述：CRISPR-Cas9系统的历史和未来。

在植物中，CRISPR-Cas9系统已被成功应用于多个物种，包括拟南芥、烟草、水稻、高粱、小麦、玉米、柑橘和苔类植物。在这些应用中，Cas9是由花椰菜花叶病毒（CaMV）35s启动子或基因特异性启动子表达的。一个核定位信号（NLS）序列融合到Cas9基因中，将CAS9传递到基因组核中。为了设计sgRNA，研究人员将靶DNA中PAM后面的20 bp序列选作sgRNA“种子区”。这些20 bp的sgRNA种子区富含在植物基因组中，超过90%的水稻基因含有一段特定的sgRNA种子区。目前，科学家们已经开发了几个软件程序，来识别靶向特异性sgRNA种子区。RNA聚合酶III启动子（如U6和U3）通常用来表达sgRNA。CaMV 35s启动子，也用来表达没有额外核苷酸的sgRNA。几种不同的sgRNAs可以在一个单一的CRISPR-Cas9系统内共同表达，以同时靶定多个DNA位点。

在植物中，CRISPR-Cas9诱导的DNA双链断裂，可以通过HR或NHEJ修复，后者主要负责基因组插入或缺失（indel）突变。CRISPR-Cas9系统是一种高效的工具，可获得具有高突变频率的靶向突变转基因植物。双等位基因突变也已在T0代转基因植株中被高频率地观察到。CRISPR-Cas9系统是推动功能基因组学研究发展的一种强大工具。定向突变也被应用于作物改良。在小麦中，CRISPR-Cas9系统诱导的TaMLO突变植株，显示出对白粉病的广谱抗病性。

过去的二十年中，诱变在功能基因组研究中扮演一个重要的角色。定向诱变是功能基因组学研究的一个有效工具。虽然最近几年ZFNs已经应用于大豆的定向诱变，但是实验难度、高成本和较低功效，限制了它的应用。

在这项研究中，研究人员成功使用CRISPR-Cas9系统在大豆中实现定向诱变，突变效率在14.7%到20.2%之间。他们预测了大豆中更多11个U6基因，然后分别利用大豆U6-10和拟南芥U6-26启动子，构建了两个载体（pcas9-gmu6-sgrna和pcas9-atu6-sgrna），以生产合成引导性RNA（sgRNAs），进行靶向基因诱变。三个基因——glyma06g14180、glyma08g02290和glyma12g37050，被选定为靶标。

研究人员在大豆原生质体中分别检测了这三个基因的突变。然后，通过发根土壤杆菌感染，将这些载体转化为大豆毛状根，从而产生高效的靶基因编辑。研究人员在转基因毛状根中检测到了glyma08g02290和glyma06g14180的双等位基因突变。

使用CRISPR-Cas9系统时，脱靶活性是很常见的。在这项研究中，研究人员检测了Glyma06g14180和Glyma12g37050基因突变的脱靶活性。脱靶活性将提高大豆饱和基因突变库构建的突变效率。利用CRISPR-Cas9系统的定向诱变，可促进大豆的功能基因组研究，尤其是与根和结节相关的基因。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system
Abstract: Genome editing is a valuable technique for gene function analysis and crop improvement. Over the past two years, the CRISPR-Cas9 system has emerged as a powerful tool for precisely targeted gene editing. In this study, we predicted 11 U6 genes in soybean (Glycine max L.). We then constructed two vectors (pCas9-GmU6-sgRNA and pCas9-AtU6-sgRNA) using the soybean U6-10 and Arabidopsis U6-26 promoters, respectively, to produce synthetic guide RNAs (sgRNAs) for targeted gene mutagenesis. Three genes, Glyma06g14180, Glyma08g02290 and Glyma12g37050, were selected as targets. Mutations of these three genes were detected in soybean protoplasts. The vectors were then transformed into soybean hairy roots by Agrobacterium rhizogenes infection, resulting in efficient target gene editing. Mutation efficiencies ranged from 3.2–9.7% using the pCas9-AtU6-sgRNA vector and 14.7–20.2% with the pCas9-GmU6-sgRNA vector. Biallelic mutations in Glyma06g14180 and Glyma08g02290 were detected in transgenic hairy roots. Off-target activities associated with Glyma06g14180 and Glyma12g37050 were also detected. Off-target activity would improve mutation efficiency for the construction of a saturated gene mutation library in soybean. Targeted mutagenesis using the CRISPR-Cas9 system should advance soybean functional genomic research, especially that of genes involved in the roots and nodules.