安徽农科院用CRISPR编辑水稻基因

CRISPR/Cas9系统逐渐成为作物育种的一种重要基因组编辑工具。虽然已有研究证明，目标突变可以传递给下一代，但是它们的遗传方式尚未完全阐明。六月十九日，安徽省农科院的研究人员在Nature子刊《Scientific Reports》发表一项研究成果，描述了CRISPR/Cas9介导的、四个不同水稻基因的基因组编辑。

　　

生物通报道：CRISPR/Cas9系统逐渐成为作物育种的一种重要基因组编辑工具。虽然已有研究证明，目标突变可以传递给下一代，但是它们的遗传方式尚未完全阐明。六月十九日，安徽省农科院的研究人员在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“Generation of inheritable and “transgene clean” targeted genome-modified rice in later generations using the CRISPR/Cas9 system”的学术论文，描述了CRISPR/Cas9介导的、四个不同水稻基因的基因组编辑。

本文通讯作者分别为安徽省农科院院长杨剑波研究员和安徽省农科院水稻研究所副研究员魏鹏程。杨剑波研究员早年毕业于安徽农业大学，1997年在中科院等离子体所获博士学位，曾赴美国明尼苏达大学研修植物生物技术，长期从事植物生物技术和辐射诱变的研究工作。主持承担国家攻关、国家“863”计划、科技部“973”项目、科技部支撑计划、国际合作项目、农业部转基因重大专项、农业部科技成果转化资金、安徽省重大科技攻关等多项科研课题。国内外重要学术刊物上发表研究论文100余篇，其中20篇被SCI收录。

魏鹏程2008年博士毕业于中国农业大学，2008年至2011年分别在美国加州大学和佛罗里达大学从事博士后研究，主要从事作物生物技术应用基础和作物逆境响应调控机理研究。现为安徽省农科院“主要农作物基因调控元件分析和应用”科技创新团队首席专家，安徽省“115”产业创新团队“水稻分子育种团队”团队助理，入选安徽省第九批学术和技术带头人后备人选。发表SCI论文20多篇,其中以第一作者或通讯作者在《Plant Physiology》《Plant Journal》《Plant Cell Environment》等国际知名刊物上发表论文十篇。

在作物中产生所需的基因多样性，是基本功能基因组学研究和农业分子育种的主要目标。利用工程核酸酶的基因编辑，例如，锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN），可有效地在植物基因组的特定位点产生遗传变异。这些核酸酶可诱导位点特异性双链断裂（DSBs），然后通过同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）修复。

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最近，更便宜和更容易使用的基因编辑系统——（CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（cas）系统，已被证明可在各种植物中实现高效的基因组编辑，包括水稻、拟南芥、烟草、小麦、高粱、玉米、番茄、苔类植物等等。由于其简单、快速和广泛的适用性，该系统已新兴成为植物生物学基础研究各个方面的一个有力工具。此外，CRISPR/Cas9系统也已成功地应用于改良作物性状。利用CRISPR/Cas9基因编辑，研究人员可同时靶定六倍体基因组中一个抗病基因的三个拷贝，在普通小麦中人工创建了抗白粉病的性状。该研究小组最近的研究也表明，通过CRISPR/Cas9基因编辑可快速改良水稻中的一种抗除草剂性状。延伸阅读：首次用CRISPR编辑树木基因组。

虽然CRISPR/Cas9已日益成功应用于位点特异性的植物基因组编辑，但是大多数的数据是来自于过渡相试验或稳定转基因事件第一代。事实上，有限的研究表明，在拟南芥、烟草、番茄和水稻中，CRISPR/Cas9产生的靶向基因组修饰可能传递到下一代。在拟南芥中，早世代中的大多数突变是体细胞突变，从而使我们很难预测下一代中的靶基因型。相比之下，在水稻中通过类似的CRISPR/Cas9系统产生的大多数假定纯合突变，表明是胚系突变，根据经典遗传学理论可以进行传递。

基因编辑因不同物种、靶位点、转基因方法和CRISPR/Cas9构建而有所差异，因此，作物中发生的传递模式仍然需要进一步探索。此外，虽然遗传模式已经在拟南芥后代中深入研究，但只有初步的数据显示了水稻后代中修饰模式的遗传传递模式。因此，应该更详细地研究水稻后代中定向编辑的遗传模式。

脱靶效应是CRISPR/Cas9系统应用中的另一个主要问题。在人类细胞中，脱靶突变实际上是由CRISPR/Cas9诱导的，但是CRISPR/Cas9在植物中的特异性尚不清楚。利用深度全基因组测序和大规模筛选的独立研究表明，脱靶突变在拟南芥、水稻和烟草中很罕见。然而，有研究小组在对一个水稻家族进行多基因敲除的时候，观察到了相对高频率的脱靶突变。在动物研究中，sgRNAs的精心设计被认为可有效避免的脱靶突变，也有研究小组开发出几种生物信息学工具，来促进植物中的sgRNA设计，但是其稳定性仍有待于实验测试。

在这项研究中，研究人员借助于在线靶标设计工具，对水稻四个不同的基因进行了CRISPR/Cas9介导的基因编辑。在T0代中观察到了高频率诱变和比例较大的假定等位基因突变。而且，这些研究结果还表明，双等位基因T0株系后代的基因型往往很难预测，突变的传递基本上不符合经典的遗传规律，这表明，T0代转基因水稻中的突变主要是体细胞突变。

接下来，研究人员探索了T1植株的遗传模式。不管是否存在CRISPR/Cas9转基因，T1株系中的突变可稳定地传递给后代，从而指出了一种标准的种系传递模式。研究人员对脱靶效应进行了评价，结果表明，通过仔细选择靶标，在CRISPR/Cas9介导的水稻基因编辑中脱靶突变是很罕见的。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Generation of inheritable and “transgene clean” targeted genome-modified rice in later generations using the CRISPR/Cas9 system
Abstract: The CRISPR/Cas9 system is becoming an important genome editing tool for crop breeding. Although it has been demonstrated that target mutations can be transmitted to the next generation, their inheritance pattern has not yet been fully elucidated. Here, we describe the CRISPR/Cas9-mediated genome editing of four different rice genes with the help of online target-design tools. High-frequency mutagenesis and a large percentage of putative biallelic mutations were observed in T0 generations. Nonetheless, our results also indicate that the progeny genotypes of biallelic T0 lines are frequently difficult to predict and that the transmission of mutations largely does not conform to classical genetic laws, which suggests that the mutations in T0 transgenic rice are mainly somatic mutations. Next, we followed the inheritance pattern of T1 plants. Regardless of the presence of the CRISPR/Cas9 transgene, the mutations in T1 lines were stably transmitted to later generations, indicating a standard germline transmission pattern. Off-target effects were also evaluated, and our results indicate that with careful target selection, off-target mutations are rare in CRISPR/Cas9-mediated rice gene editing. Taken together, our results indicate the promising production of inheritable and “transgene clean” targeted genome-modified rice in the T1 generation using the CRISPR/Cas9 system.