Nature发布CRISPR-Cas9重大新成果

　　

生物通报道  来自麻省总医院的一个研究小组找到了一种新方法来扩大强大基因编辑工具——CRISPR-Cas9 RNA引导核酸酶的使用及提高其精确性。他们的研究论文在线发表在6月22日的《自然》（Nature）杂志上。

在这篇Nature文章中，研究人员描述了一种演化版本的DNA切割酶Cas9。相比于迄今为止使用的自然形式的Cas9，演化版本的Cas9能够识别前者无法靶向的不同范围的核酸序列。

论文的主要作者、麻省总医院分子病理学部研究人员Benjamin Kleinstiver博士说：“在我们的论文中我们证实了采用我们设计改进的新的Cas9变体，现在可以靶向过去用野生型Cas9无法改造的人类和斑马鱼基因。这将使得研究人员能够靶向各种基因组中扩大范围内的一些位点，这对于需要高度精确靶向DNA序列的一些应用将会有用。”

CRISPR-Cas9核酸酶是由细菌Cas9酶和一段与DNA靶序列相匹配的、20个核苷酸的短RNA分子所构成。除了RNA/DNA匹配，Cas9酶还需要识别靶DNA附近、称作为前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif,PAM)的一段特异核苷酸序列。最常用的Cas9来自于酿脓链球菌，被称作为SpCas9。SpCas9可以识别任何核苷酸后面有两个鸟嘌呤DNA碱基的PAM序列。这将SpCas9靶向的PAM序列局限为必须包含两个连续鸟嘌呤的DNA序列。

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为了解决这一限制，麻省总医院研究小组建立了一个工程系统，使得他们能够快速地演化SpCas9识别不同PAM序列的能力。通过收集随机突变的SpCas9变体，他们鉴别出了使得SpCas9能够新PAM序列的突变组合。这些演化变体基本上让SpCas9可以进行靶向基因编辑的位点范围扩大了一倍。

他们还意外地发现了一种更少可能诱导出脱靶基因突变的SpCas9变体。新论文的资深作者、麻省总医院病理科副主任J. Keith Joung曾在其领导的2013年的一项研究中描述了CRISPR-Cas9核酸酶有时会生成脱靶基因突变这一问题。“应将这一特异性增高的改良SpCas9变体立即提供给当前采用野生型SpCas9的研究人员，这应该会减少不必要脱靶突变的频率，”Joung说。

Joung补充道：“或许更为重要的是，我们的研究发现第一次证实了可以通过定向的蛋白质演化来改变SpCas9的活性。事实上，我们在论文中证实了存在于另外两种细菌——金黄色葡萄球菌和嗜热链球菌中的Cas9形式也可以在我们的细菌演化系统中发挥功能，表明我们应该也能够改变它们的功能（延伸阅读：张锋Nature重大突破：用新型高效Cas9实现基因组编辑 ）。对于Cas9可靶向的PAMs的范围，这项研究工作还只是了解了皮毛，我们相信通过相似的方法还可以改变Cas9酶其他的有用特性，使得有可能定制化许多重要的特性。”

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities

Although CRISPR-Cas9 nucleases are widely used for genome editing1, 2, the range of sequences that Cas9 can recognize is constrained by the need for a specific protospacer adjacent motif (PAM)3, 4, 5, 6. As a result, it can often be difficult to target double-stranded breaks (DSBs) with the precision that is necessary for various genome-editing applications. The ability to engineer Cas9 derivatives with purposefully altered PAM specificities would address this limitation. Here we show that the commonly used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) can be modified to recognize alternative PAM sequences using structural information, bacterial selection-based directed evolution, and combinatorial design. These altered PAM specificity variants enable robust editing of endogenous gene sites in zebrafish and human cells not currently targetable by wild-type SpCas9,