PNAS：新型神经细胞培养基克服传统障碍

最近，美国索尔克生物研究所的科学家发现，即使是传统的培养基，也会强烈地改变许多重要的神经生理特性。为此，他们研制了一种新的培养基——BrainPhys，可改善神经元的分化和电活动，支持长期的体外培养，模拟活脑的生理条件，并允许对电生理活动进行评估。这一研究成果发表在最近的《PNAS》。

　　

生物通报道：体内的神经电活动是神经系统功能的本质，控制着感官、情感、记忆、行为和基本的生存机能。因此，要在实验室内研究神经元，很重要的一点是，在体外培养的神经元模型也支持这种电活动，才能反映基本的大脑功能，目前大多数的人类神经元培养是使用传统培养基DMEM（Dulbecco的改良Eagle培养基）、Neurobasal或两者的混合物。与此相反，室内试验在脑切片或培养物使用电生理技术–如膜片钳（允许单个或多个细胞离子通道的研究）、钙成像，是在人工脑脊液（aCSF）培养基中进行的。延伸阅读：神经细胞培养：不再难于上青天。

最近，美国索尔克生物研究所、Sanford再生医学财团的科学家，使用诱导多功能干细胞（iPSCs），在体外模拟人类神经系统疾病，应用电生理技术测试DMEM和Neurobasal，以确定它们对基本神经元活动的影响。令人惊讶的是，科学家发现，即使这些是传统的培养基，它们也会强烈地改变许多重要的神经生理特性。在决定设计一种新的培养基之前，研究人员测试了各种市售的可用于神经组织培养的基本培养基；没有哪一种像aCSF一样支持电生理活动。然而，即使加入了各种添加剂，aCSF不足以维持细胞培养超过一天或两天。因此，科学家们开始设计一种新培养基（更适合支持神经元的功能），这是一项具有挑战性的任务，从而最终产生了一种新的培养基——BrainPhys，可改善神经元的分化和电活动，支持长期的体外培养，模拟活脑的生理条件，并允许对电生理活动进行评估。

Cedric Bardy博士和他的同事们，将这一研究成果发表在最近的《美国国家科学院院刊》（PNAS）。Bardy告诉Medical Xpress：“我们认为，要真正评估神经细胞培养物的生理学，在相同培养基中进行电生理实验更有意义。当时，我们绝对没想到传统培养基会损坏神经元的活动。我们开始尝试用膜片钳技术，在传统组织培养基中测试人类神经细胞的电生理特性，同时我们可以记录这些培养基中的一些动作电位，突触活性被完全沉默。”

然而，在研究人员开始质疑培养基之前，他们认为，问题可能是由于人类神经元，或他们刚刚建成的新膜片钳设备。用aCSF代替培养基，通过在小鼠脑切片上进行膜片钳技术，他们迅速排除了这些假设，发现这些实验在记录活性方面是非常成功的。Bardy回忆说：“接下来的一天，我们返回修补人类神经元。我们开始是在传统培养基中记录，我们再次记录到一些可怜的动作电位活动，但没有突触活动。这一次，虽然修补同样的细胞，但是我们把细胞外液切换到aCSF。这大大提高了神经元的功能，然后我们通过钙离子成像进行了验证。我几乎不敢相信它！我们惊奇地发现，几十年来我们一直在含刺激神经组织成分的培养基中培养神经细胞，这种成分会大大损害这种基本和重要的神经功能。”此外，他补充说，至少在大多数情况下，组织培养模型要概括尽可能真实的体内条件，这是很重要的。由于突触和电活动对大脑的任何功能绝对是关键的，他们的主要目标是研制某种组织培养条件，从生理上支持这样的活动。

Bardy回忆说：“研制一种新培养基并不是一个简单的任务，但是我们不能忽视的事实是，我们正在使用的培养基，会大大损害神经元的功能。有些时候我们认为，传统培养基DMEM或Neurobasal可能有一种组分，会沉默神经元的活动，挑战在于，这些培养基包括50多种不同浓度的组分。可能的组合数量是巨大的。”

科学家们首次尝试确定哪些组分对于神经元的存活和活动至关重要，他们移除组件——例如，所有的氨基酸。Bardy说这是有益的，因为这明确表明，不仅仅是一个组分的问题。他说：“我们设法缩小可能的问题清单，在这一点上，我们试图根据关于‘刺激神经的关键组分是什么’的文献，做出可理解的猜测。我们还根据自然人脑脊液的成分，调整了一些组分的浓度；在最后得到BrainPhys之前，我们不得不尝试几种浓度和几个不同版本的培养基，BrainPhys像aCSF一样能支持神经元电活动，同时还能够支持体外神经细胞的长期生存。”

一个重要的好处是，随着时间的推移，新的神经元培养基中的神经活性增强，不利于细胞生存。相反，科学家们发现，长期暴露于BrainPhys中可显著增强人类神经元的突触功能。这些功能性改善伴随而来的是ARC蛋白的显著增加，众所周知这在突触强度和记忆巩固中发挥关键的作用。

Bardy指出，用人iPSC技术而不是动物模型，其中一个主要的优势是，实验模型虽然更接近于人，但这是以失去体内组织的维度为代价。他解释说：“作为细胞生物学家，我们必须通过推动新的组织实验模型，来弥补这一事实，这将允许我们在体外研究组织，能够更好地模拟体内相同组织的结构和功能。我们应该做出许多改进——例如，神经元生长的物理基板，或孵化器中的氧含量。BrainPhys可帮助我们从一个更准确的生理角度研究神经元培养，应该会为新的、更严格的神经元和突触功能研究，打开新的途径。这项研究还指出，细胞生物学家们需要重新思考一下组织培养条件，虽然我们已经用了几十年都没有问题。作为研究人员，我们应不断提高试验模型的精度和相关性——不仅在神经科学研究，而且在其他医疗应用，如癌症、心脏病与自身免疫性疾病。”Bardy指出，毕竟，自出现人类iPSC技术以来，在体外模拟人类神经系统疾病的投入力度成倍增长。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro
Abstract: Human cell reprogramming technologies offer access to live human neurons from patients and provide a new alternative for modeling neurological disorders in vitro. Neural electrical activity is the essence of nervous system function in vivo. Therefore, we examined neuronal activity in media widely used to culture neurons. We found that classic basal media, as well as serum, impair action potential generation and synaptic communication. To overcome this problem, we designed a new neuronal medium (BrainPhys basal + serum-free supplements) in which we adjusted the concentrations of inorganic salts, neuroactive amino acids, and energetic substrates. We then tested that this medium adequately supports neuronal activity and survival of human neurons in culture. Long-term exposure to this physiological medium also improved the proportion of neurons that were synaptically active. The medium was designed to culture human neurons but also proved adequate for rodent neurons. The improvement in BrainPhys basal medium to support neurophysiological activity is an important step toward reducing the gap between brain physiological conditions in vivo and neuronal models in vitro.