KASP——基因分型研究者指尖跳跃的珠链

KASP技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光引物，它基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测*终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了LGC KASP的试剂成本，既有金标准的准确，又降低了使用成本，比Taqman还具有更好的位点适应性，所以在医学、农学检测方面LGC KASP都有非常好的应用。

说起SNP Genotyping，大家熟悉的产品很多。例如*经典的Taqman荧光探针法，至今也是Genotyping的金标准。还有Sequenome Massarray飞行时间质谱法，在医学方向应用很多，也有很多商品化检测试剂盒，不过Sequenome需要引物组合做多重PCR，摸索优化难度比较大，耗材成本也不低。前几年大家经常提起的，高分辨熔融曲线HRM也算一个吧，HRM以高灵敏，低成本，灵活的优势深受不少科研工作者的喜爱，只是这项技术对于引物设计和实验操作，仪器的灵敏度和重复性要求都比较高，HRM都是针对一段DNA片段而不是一个位点进行熔融温度差异分析，片段的长短，碱基差异，碱基构成都是影响因素，重复性并不好，HRM更适合于寻找突变体，而非SNP检测，所以大部分客户体验并不好。

那么今天要分享的基因有限公司代理产品，英国LGC公司的KASP技术，原理上类似Taqman检测，也是基于终端荧光读取判断，每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型，不同的SNP模板对应不同的荧光产物。所以这项技术的准确度与金标准Taqman一致，而KASP技术与Taqman技术不同的是，它不需要每个SNP位点都去合成特异的荧光引物，它基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测*终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了LGC KASP的试剂成本，既有金标准的准确，又降低了使用成本，比Taqman还具有更好的位点适应性，所以在医学、农学检测方面LGC KASP都有非常好的应用，并在一系列高水平的文章中都有体现，后续我们会继续介绍。

从具体技术上比较，Taqman探针，一般采取8-12个bp的长度，围绕SNP位点两端进行设计，但对于整个基因组，如此短的探针，可能导致存在多个同源序列进行扩增，造成背景增高，目标位点的完全匹配杂交信号降低，相对而言，KASP的特异性引物通常采用24-26bp，会有更高的特异性，SNP call rate会更高。

另一种情况，可能存在相邻只有几个bp的SNP位点，Taqman探针设计的转化就很困难，因为Taqman的SNP位点必须设计在探针的中间，有可能杂交信号很弱，同样，如果目标位点存在单碱基多次重复序列，Taqman探针方法转化也也很困难，对于这两类位点，KASP方法，因为是末端识别目标位点，可以很好的解决此事。

除了检测SNP位点以外，因为引物片段达到24-26bp，KASP还可以适用于检测较大片段的插入Indels。

还有一个优势，就和钱包有关了，关键问题一，质保期，因为KASP是分成非标记的引物和荧光标记的Master Mixer两部分保存，前者是非荧光标记，质保期长，后者是长期通用性消耗品，客户根据自己消耗量进行采购，浪费少，而Taqman探针是荧光标记的，每一份都是针对特定位点设计合成的，如果有效期内不能充分使用，就会浪费。

别只算纸面成本，那都是假设使用充分为前提的，还是设想一下实际应用场景吧，打开超低温冰箱看一下，前任们留下了多少荧光探针呀，那都是老板的钱呀。

关键问题二，对于新位点的摸索优化条件，只需要设计引物就行了，就和您做一个新的PCR实验相当，KASP技术与客户本身的PCR体系更为接近，其优化也更简单，更有效率。无需订制Taqman探针，甚至购买昂贵的Massarray耗材，据说有个大牛规定，严禁学生私自使用Sequenom 进行新位点摸索，防止掉进坑里。

KASP技术，就是基因分型研究者指尖跳跃的珠链，随性，灵动。

在SNP的系统性研究中，我们一般首先使用NGS测序，构建研究物种或性状的SNP数据库，或者直接调用公共数据库，然后使用芯片或者其他中等密度SNP研究平台在实验组和对照组中进行SNP的筛选，也就是所谓的"GWAS“全基因组关联分析，当候选SNP的数量降到几十个或更少时，也就是低SNP密度高样本通量时，KASP就是*合适的技术了，可以用于replication实验组，进行大样本量的分型。

KASP技术具有灵活、便宜、准确的特点，采用KASP技术进行SNP检测的文献连篇累牍，目前已经超过2000篇，其中的著名刊物比比皆是，略举一二。

2014年1月Nature Genetics发表题为“A genome-wideassociation study identifies multiple susceptibility loci for chroniclymphocytic leukemia”的文章，这篇关于慢性淋巴细胞白血病的研究先是使用全基因组高密度SNP芯片进行GWAS分析，得到若干候选SNP，为了判断这些候选SNP是否与表型相关，又设计replication组进行验证，合计2组，分别是803/2780（case/control）和341/371，全文在4295个人中分析GWAS分析中得到的7个候选SNP，反应量超过3万，用的就是LGC KASP技术。

2013年11月Blood发表题为“Variation at 10p12.2 and 10p14influences risk of childhood B-cell acutelymphoblastic leukemia and phenotype”的文章，英国癌症研究所基于German GWAS研究已经证实7p12.2，9p21.3，10q21.2，14q11.2与BCP-ALL相关。在此基础上他们吸收了前人发表的同类GWAS数据进行Meta分析，联合分析后找出8个位点进入replication验证，使用的就是KASPar平台，*后找出2个相关位点，rs10828317和rs3824662，分别影响了PIP4K2A和GATA3基因，都与ALL显著相关。而且后者可以作为生存率的判断指标。

2013年6月Science发表题为“Identification of Wheat GeneSr35 ThatConfers Resistance to Ug99 Stem Rust Race Group”的文章，鉴定了小麦的抗杆锈病基因CL9，是典型的对QTL进行精细扫描来鉴定功能基因的思路。Sr35是之前在一粒小麦（Triticummonococcum）中确定的含抗杆锈病基因的QTL，该QTL在3Am染色体的长臂，长度大约是2.2-3.1cM（1cM大约是100万对碱基的长度）。该QTL有很多基因，Science该文就是对该QTL进行精细扫描，来寻找具体的抗杆锈病基因。首先，在该QTL内，进行7个分子标记（ssr等）的扫描，把候选基因锁定在2个分子标记之间，该区域长度大概为0.97cM；接着，在一粒小麦的抗病品系DV92的BAC文库中筛选出含此QTL的BAC克隆，对含此QTL的3个BAC克隆进行NGS测序，长度为307,519bp，并对其中的多个基因进行生物信息学分析。对该区域进行进一步分子标记（SSR等）分析，发现其中213kb区域内的4个基因（APGG1,CNL4, CNL6， CNL9）是抗杆锈病候选基因。进一步，对不同的一粒小麦的这4个基因进行一代测序，鉴定出2个抗性单倍型和6个易感单倍型；被测序的小麦包括24种抗杆锈病的和25种杆锈病易感的。所有易感的一粒小麦的CL9基因都具有突变，其中3个SNP导致编码氨基酸的序列改变。其中测序发现的SNP的后续分析就是采用KASP技术（8微升体系，在StepOnePlus™ Real-Time PCR System (AppliedBiosystems)运行检测,KASP技术的另一个突出特点就是仪器系统的开放性，使用实验室本身的定量PCR进行检测，事先进行测试设定就可以了）。

随着KASP的技术不断成熟，越来越多的实验室选择相应的LGC SNPLine仪器平台，建立自己的高通量SNP分析平台，基因有限公司也已经引进全套仪器平台，开始高通量SNP技术服务工作，对于研究SNP的科学家而言，又多了一种选择。

对于LGC公司，KASP技术，SNP技术服务，有任何问题，请咨询您身边的基因有限公司人员。