王皓毅博士教你玩转CRISPR–Cas9

　　

生物通报道  由于其无与伦比的易用性，及具有改造整个哺乳动物模型系统基因组的能力，CRISPR和Cas蛋白已逐步成为极其强大的基因组编辑工具。因此，CRISPR–Cas9系统有望作为一种“选择性的系统”广泛用于生物学科领域的功能性遗传研究。

近日，中国科学院动物研究所的王皓毅(Haoyi Wang)研究员在《Mamm Genome》杂志上发表了一篇题为“CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design”的文章。

在这篇文章中，他和合著者们不仅简要地为我们概述了这一快速发展的领域，介绍了CRISPR–Cas9系统以及它在基因组编辑中的应用，还着重介绍了设计CRISPR/Cas9向导RNA(guide RNA, gRNAs)的基本要点，减少脱靶效应的策略，利用CRISPR/Cas9构建小鼠模型的基本策略和注意事项，以及CRISPR/Cas9当前面临的一些挑战以及未来的发展。当前这篇论文可在线免费获取（延伸阅读：华裔学者Nature子刊提高CRISPR/Cas9基因组编辑精确度 ）。

设计CRISPR/Cas9导向序列——获得高靶向效率和特异性

合理设计CRISPR导向序列的目的在于最大程度实现对靶位点的预期遗传改造，将脱靶位点的意外突变降至最少。为了确定影响脱靶效率的参数，近期的一些研究工作调查了靶序列组成对于脱靶效率的影响，发现导向序列中GC含量过高或过低的都可以导致低效率。

此外， CRISPR–Cas9靶向特异性是由定位在sgRNA 5′端的一段20 nt的导向序列，以及基因组位点中靠近靶位点的PAM序列所决定。由于导向序列和靶DNA之间的错配可在一定程度上被容忍，尤其是在PAM序列的远端区域。因此，导向序列应尽可能地避免与多个基因组位点匹配或高度相似，以防止脱靶效应，在细胞或生物基因组中造成意外的、通常检测不到的遗传转变。为了帮助研究人员设计好CRISPR–Cas9实验，作者们在这篇论文中列举出了一些当前可获得的、用来设计导向RNA和预测脱靶概况的软件工具（表1）。

减少脱靶效应的策略

此外，在文章中作者们列出了一些可与表1中的软件系统联合使用减少脱靶效应的一些主要的方法。

（i）借助于全基因组同源性检索确定及选择出具有最少潜在脱靶位点的导向序列。然后在其中选择脱靶错配集中在导向序列PAM近端的sgRNAs。

(ii)采用长度较短（17–19 nt）的导向序列。

(iii)采用双切割酶策略。利用一对位置靠近的sgRNAs，Cas9切割酶可以导入两个靠近的单链切口，生成带有定义突出端的DNA双链断裂。这种方法已在细胞系中被证实可以将脱靶活性降低50-1500倍，并在小鼠受精卵中实现基因敲除而不影响靶向切割效率。

(iv)采用dCas9-FokI策略。利用一对优化间距和定位的sgRNAs，与Fok1核酸酶结构域融合的dCas9可以形成二聚体，并生成DNA双链断裂，这与ZFN和TALEN的设计相似。利用这种策略可以大大提高特异性。

(v)鉴别和减少脱靶。除了计算预测，研究人员还开发了几种策略来鉴别脱靶突变。通过对这些潜在的脱靶位点进行基因分型，可以鉴别出包含所需遗传改造、免于脱靶突变的细胞系。在动物模型中，可以采用交配的方法来分离所需的等位基因和脱靶突变等位基因。

作者指出，这些策略每一个都有自身的优点和局限性。

用CRISPR/Cas9介导小鼠基因组编辑的概要图

为了帮助理解CRISPR–Cas9介导基因组编辑的一般过程，作者还以概要图形式列出了利用CRISPR–Cas9系统来构建小鼠模型的一些基本策略和注意事项（表2）。

在文章的最后，作者们还探讨了提高CRISPR–Cas9系统的特异性和效率，构建动物们模型面临的一些挑战，利用sgRNA的骨架来扩大效率，以及扩展CRISPR–Cas9系统的用途等方面。

作者简介：

王皓毅

男，1979年10月出生于河北省，博士，研究员，中国科学院动物研究所基因工程技术研究组组长。

2001年于厦门大学获得生物学学士学位，2003年于美国迈阿密大学获得动物学硕士学位。2009年于美国华盛顿大学获得分子细胞生物学博士学位，研究方向为转座子基因工程技术。2009年至2014年在麻省理工学院Rudolf Jaenisch实验室进行博士后研究，研究方向为特异性定点核酸酶在全能性干细胞和小鼠中的基因工程技术开发。主要研究方向为基因工程技术和表观遗传修饰技术的开发和应用，在近年研究中取得多项成果，包括率先成功地利用TALEN系统对于人类胚胎干细胞和诱导性干细胞进行了精确高效的基因敲除和敲入操作；利用TALEN系统建立了世界上第一只Y染色体上的基因敲除和敲入小鼠；率先利用CRISPR/Cas系统建立了在胚胎干细胞中进行多基因敲除的方法，并通过受精卵注射一步获得多基因敲除的小鼠；通过受精卵注射CRISPR/Cas系统的同时提供DNA单链和双链供体，获得基因原位敲入小鼠和条件性敲除小鼠。相关研究成果发表在Cell、Nature Biotechnology、Genome Research、Cell Research等杂志上，并获得科学同行的极大关注和科学媒体的广泛报道，曾被著名科学网站GenomeWeb评选为全世界二十名最值得关注的青年科学家之一。已发表SCI收录论文16篇，影响因子10分以上11篇，总引用次数超过800次。

生物通推荐原文摘要：

CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design

CRISPR and CRISPR-associated (Cas) proteins, which in nature comprise the RNA-based adaptive immune system in bacteria and archaea, have emerged as particularly powerful genome editing tools owing to their unrivaled ease of use and ability to modify genomes across mammalian model systems. As such, the CRISPR–Cas9 system holds promise as a “system of choice” for functional mammalian genetic studies across biological disciplines. Here we briefly review this fast moving field, introduce the CRISPR–Cas9 system and its application to genome editing, with a focus on the basic considerations in designing the targeting guide RNA sequence.