华裔牛人Nature子刊将CRISPR-Cas9特异性提高25倍

来自哈佛大学、麻省总医院的研究人员报告称，他们通过采用小分子激活条件性Cas9蛋白的新策略，将基因组编辑的特异性提高了25倍。这一重要的研究成果发表在4月6日的《自然化学生物学》（Nature Chemical Biology）杂志上。

　　

生物通报道  来自哈佛大学、麻省总医院的研究人员报告称，他们通过采用小分子激活条件性Cas9蛋白的新策略，将基因组编辑的特异性提高了25倍。

论文的通讯作者是哈佛大学化学及化学生物学教授，霍华德休斯医学研究所研究员David R. Liu。据称这位教授是一位从来没有做过博士后的年轻教授，他早年毕业于哈佛大学，1999年在加州大学伯克利校区攻读博士学位，在Peter Schultz教授指导下从事核糖核酸研究，并自主首次开始活细胞遗传密码的研究。之后就被哈佛大学任命为助教授，2004年晋升为教授。Liu教授曾被麻省理工学院技术评论列入全球Top 100 青年发明家（35岁以下），“大众科学”亦将其列入全美Top10最具才气的青年科学家（延伸阅读：哈佛华裔牛人Nature子刊发布基因组编辑新技术 ）。

作为一种对抗入侵病毒和质粒的防御系统，CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中。来自化脓链球菌的II型CRISPR-Cas系统依赖于一种蛋白核酸酶Cas9和两个非编码RNA: crRNA和tracrRNA来靶向DNA。这两个非编码RNAs可进一步融合成一种单导向RNA (single-guide RNA,sgRNA)。Cas9/sgRNA复合物结合到与sgRNA的前17-20个核苷酸相匹配的双链DNA序列上，以NGG序列形式存在的的前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）紧随在这一靶序列之后。

一旦结合，Cas9中两个独立的核酸酶结构域将会在PAM区上游对基因组DNA进行切割，造成DNA双链断裂(DSB)。DSBs可通过非同源末端连接(nonhomologous end-joining,NHEJ)信号通路或是同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR)来获得修复。NHEJ通常会在切割位点附近造成短插入/删除(indels)，而在提供外源模板DNA的情况下可以利用HDR将特异序列导入到切割位点。这一研究发现为Cas9作为一种基因工程工具应用于各种物种中铺平了道路。

近年来，多个研究小组利用错配gRNA文库、体外筛选和报告基因检测广泛地鉴别了化脓链球菌Cas9的特异性，证实Cas9以一种对错配数量、位置和分布敏感的方式可以容忍导向序列中的一些错配。由于基因组编辑是造成基因组永久的改变，Cas9的靶向特异性成为了其是否适用于临床应用及基因治疗的一个尤为关切的问题。提高特异性也是当前Cas9系统应用研究中的一个热点。

在这篇新文章中作者们提出，在靶向位点修饰后直接调控及降低基因组编辑蛋白的活性，有可能是提高它们特异性的一种潜在方法。他们通过将4-羟基他莫昔芬（hydroxytamoxifen）反应性的内含肽(Intein)插入到Cas9的特异位点，开发出了可被一种细胞渗透性小分子激活的Cas9核酸酶。他们证实在人类细胞中，相比于野生型Cas9，这些条件性激活的Cas9s将改造靶基因组位点的特异性提高了25倍。

这一重要的研究成果发表在4月6日的《自然化学生物学》（Nature Chemical Biology）杂志上。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Small molecule–triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity

Directly modulating the activity of genome-editing proteins has the potential to increase their specificity by reducing activity following target locus modification. We developed Cas9 nucleases that are activated by the presence of a cell-permeable small molecule by inserting an evolved 4-hydroxytamoxifen–responsive intein at specific positions in Cas9. In human cells, conditionally active Cas9s modify target genomic sites with up to 25-fold higher specificity than wild-type Cas9.