华南农大Cell子刊发表CRISPR/Cas9研究新文章

　　

生物通报道  来自华南农业大学的研究人员报告称，他们开发出了一种适用于在单子叶植物和双子叶植物中，实现方便、高效多重基因组编辑的强大的CRISPR/Cas9系统。研究成果在线发表在Cell出版社旗下子刊《Molecular Plant》杂志上。

领导这一研究的是华南农业大学生命学院长江特聘教授刘耀光（Yao-Guang Liu）。其主要研究领域为植物基因工程、水稻基因的定位与克隆、水稻分子生物学。

近年来，各种遗传工具如潮水般涌现，尤其是序列特异性的核酸酶为位点特异性基因组编辑带来了重大的突破。锌指核酸酶（ZFNs）是利用3个锌指结构域来识别DNA，每个锌指结构域识别3个碱基。转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)则通过源自植物病原菌黄单胞菌 的TAL效应子来结合DNA。TAL效应子中的DNA识别单位几乎是完全相同的串联重复单位；每个单位识别一个碱基。尽管已有研究报道利用ZFNs和TALENs成功实现了基因打靶，但构建ZFNs的结合结构域在技术上相对困难，TALENs结合结构域的重复特性过于复杂，引发了人们对于载体在细菌和植物基因组中稳定性的担忧。此外，ZFNs和TALENs是以二聚体形式发挥功能也使得载体构建和转化过程变得更加的复杂。

新基因编辑工具CRISPR/Cas9的出现给这一领域带来了新的突破（延伸阅读：华裔学者Nature子刊提高CRISPR/Cas9基因组编辑精确度）。这一系统借助于一条序列特异性的单导向RNA (single-guide RNA,sgRNA)将Cas9蛋白引导至靶位点处发挥核酸酶作用。不同于ZFNs和TALENs利用蛋白结合结构域，CRISPR/Cas9的位点特异靶向性是由sgRNA的前20个核苷酸所决定。尽管现已被应用于包括植物在内的多种生物体中进行基因组打靶，但当前大多数的CRISPR/Cas9系统在植物中还只能用于改变一个或少数几个的靶位点。

在这篇新文章中研究人员报告称，他们利用设计合成的植物优化密码子Cas9基因，构建出了一种强大的CRISPR/Cas9载体系统，适用于在单子叶植物和双子叶植物中实现方便、高效的多重基因组编辑。他们设计出了一种基于PCR的程序来快速构建多个sgRNA表达盒，并采用Golden Gate ligation或Gibson Assembly连接方法在一轮克隆中将表达盒装配到CRISPR/Cas9双元载体中。

利用这一系统，研究人员在水稻中编辑了46个靶位点，突变率平均为85.4%，其中大多数为双等位基因突变(biallelic mutation)和纯合突变。他们推断在水稻中大约16%的纯合突变是通过非同源非同源性末端连接及随后的同源重组修复产生。在拟南芥T1植物中他们还获得了均衡的双等位基因突变、纯合突变和嵌合突变。并证实在水稻和拟南芥中的这些定点突变都是可以遗传的。通过同时靶向一个基因家族的8个成员，一条生物合成信号通路中的多个基因，或是单基因中的多个位点，研究人员提供了一些在T0水稻和T1拟南芥中功能缺失基因突变的示例。

这一新系统为在植物基础研究中探究多个基因和基因家族的功能以及实现遗传改良提供了一个通用工具箱。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

A robustCRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants

CRISPR/Cas9 targeting systems have been applied to a variety of species. However, most of current CRISPR/Cas9 systems for plantscan only modify one or a few target sites. Here, we report a robust CRISPR/Cas9 vector system, utilizing a plant codon-optimized Cas9 gene, for convenient and high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants……

作者简介：

刘耀光

博士，研究员，博士生导师,教育部****特聘教授,广东省教育厅植物基因组学与生物技术重点实验室主任,（省部共建）教育部水稻育性发育与抗逆重点实验室主任,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室副主任

工作经历
1982.3-1984.8  湖南省长沙市农业专科学校，助教
1991.4-1993.3 日本三井植物生物技术研究所，博士后
1993.4-1996.6 日本三井植物生物技术研究所，研究员
1996.7- 现在   华南农业大学生命科学学院遗传工程研究室，研究员

学习经历
学位 学历 学科门类 专业 毕业学校 类型 入学时间 毕业时间
博士 博士研究生 农学 植物遗传学 日本京都大学 全日制 1988-04 1991-03
硕士 硕士研究生 农学 作物遗传育种 日本香川大学 全日制 1985-10 1988-03
学士 大学本科 农学 作物遗传育种 华南农业大学 全日制 1978-03 1982-02

主要研究领域
植物基因工程、水稻基因的定位与克隆、水稻分子生物学。目前主要研究课题包括水稻细胞质雄性不育基因及其恢复基因的克隆和分子机理、水稻杂种不育基因的克隆和分子机理、水稻生殖发育的分子调控等。