Nature子刊：特殊染色法破解大脑奥秘

　　

生物通报道：人们普遍认为，学习是基于神经细胞之间的连接的变化。了解哪些神经细胞与其他神经细胞连接，对我们理解“大脑是如何工作的”是相当有帮助的。因此，科学家们一直梦想着能够绘制并解码神经连接体（connectome）——大脑的电路图。延伸阅读：美国院士PNAS解决百年大脑争议。

最近，马克斯普朗克神经生物学研究所的Shawn Mikula和Winfried Denk，开发出一种特殊的染色方法，弥补了最后一个方法上的差距：如何染色整个大脑，相关研究结果发表在四月十三日的《Nature Methods》。现在，绘制完整的小鼠大脑似乎是触手可及的，但即便设备效率像设计的那样，收集数据也需要几年的时间，而且，分析大约40千兆字节的数据，可能需要几十年的时间。

自从十九世纪末科学家首次在显微镜下检测到神经细胞以来，已经发生了很多事情。健康及病变大脑的解剖学、化学和细胞生物学，已经得以广泛的探讨。然而，人的想法和感受如何来自单个细胞的活性？当细胞从网络上分离时（退行性疾病）会发生什么？目前还不明确。因此，了解神经网络的连接并发现所有这些连接，对于联接组学（connectomics）的目标显然是很重要的。

人类大脑含有1千亿左右的细胞与细胞间连接。虽然绘制人类大脑的神经连接是真正的科幻小说，但是串行块面扫描电子显微镜及其他影像学分析方法的发展，已经带来了小鼠大脑的神经连接体，小鼠大脑比人的大脑小3000倍，是触手可及的。Shawn Mikula说：“一个关键的步骤——仍然下落不明，是全脑样品制备。”在过去的六年里，他一直致力于完整小鼠大脑组织染色，以便整个大脑的对比是均匀的，并且追踪大脑线路和检测突触所需要的超微结构信息没有被破坏。以前的染色方法只能可靠地染色比较小的组织样本。但是，一旦大脑被分成小块神经丝，可能不再继续在碎块之间，从而不能产生其后的每一代全脑图。旨在染色全脑的方法可能使大脑染色太弱或不均匀，或者它们会毁坏大脑结构。因此，所有神经细胞连接的重建，仍然是不可能的。

现在，Shawn Mikula和Winfried Denk提出了一种全脑染色方法——BROPA。BROPA缩写代表着一系列复杂的染色和漂洗步骤，包括锇和邻苯三酚溶液。整个染色过程大约需要四周。Shawn Mikula解释说：“我的忍耐是痛苦的，因为直到这个过程结束，我们才能知道染色过程中的变化是好的还是坏的。”但是，经过很多等待和精炼，两位科学家都对这种新方法非常满意：“我们的研究结果表明，用串行块面扫描电子显微镜，在一只BROPA染色小鼠大脑中，能可靠地追寻到单个轴突，并识别突触。”

马克斯普朗克神经生物学研究所主任Winfried Denk解释说：“我们的目标是，在电子显微镜下，用所有神经细胞和连接来记录完整的小鼠大脑，现在我们向这个目标迈出了重要的一步。”一旦新一代仪器交付并被测试——这计划花费一年的时间，科学家就打算启动项目。Denk说：“我估计，只收集数据就将需要大约两年半的时间。在这段时间里，会产生大约40千兆字节的数据。我们将以某种方式管理这些数据存储，这是我们仍然担心的分析。”

到目前为止这些结果表明，自动化的计算机程序可以相当可靠地识别BROPA染色的突触和细胞体。但即使是罕见的中断也会让神经纤维非常分散。Winfried Denk说：“我相信我们能够解决好这个问题。”在人类基因组破译的背景下，实际上这听起来并不是天方夜谭：当70年代中期第一个DNA片段被解码时，测定整个人类基因组的序列跟现在绘制整个人类大脑的连接组一样，最初看起来是不可能的。

（生物通：王英）

注：Winfried Denk是德国物理学家，马克斯普朗克神经生物学研究所的主任。他1990年在瓦•韦伯的实验室做博士后研究员时率先实现了双光子显微镜。Denk后来（1994年）认识到双光子显微镜活细胞成像的深高散射问题上具有独特的性能。他的第二个重大发明是一台机器，可以自动获取分辨率为几纳米的三维图像。这种技术被称为串行块面扫描电子显微镜，已被加坦公司商业化。他在2003年被授予戈特弗里德•威廉•莱布尼茨奖和2012年卡夫利奖。2013年成为美国国家科学院外籍会员。

生物通推荐原文摘要：
High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction
Abstract: Currently only electron microscopy provides the resolution necessary to reconstruct neuronal circuits completely and with single-synapse resolution. Because almost all behaviors rely on neural computations widely distributed throughout the brain, a reconstruction of brain-wide circuits—and, ultimately, the entire brain—is highly desirable. However, these reconstructions require the undivided brain to be prepared for electron microscopic observation. Here we describe a preparation, BROPA (brain-wide reduced-osmium staining with pyrogallol-mediated amplification), that results in the preservation and staining of ultrastructural details throughout the brain at a resolution necessary for tracing neuronal processes and identifying synaptic contacts between them. Using serial block-face electron microscopy (SBEM), we tested human annotator ability to follow neural ‘wires’ reliably and over long distances as well as the ability to detect synaptic contacts. Our results suggest that the BROPA method can produce a preparation suitable for the reconstruction of neural circuits spanning an entire mouse brain.