华人学者技术突破：将CRISPR应用于分子克隆

　　

生物通报道  所有的分子生物学家都会告诉你：将DNA片段克隆到载体中去是一件棘手的事情。研究人员要查看复杂的限制性酶切图谱，费尽心力找到适当的限制性内切酶组合，然后熬过漫长的连接和转化过程，希望能够生成少数正确插入的克隆。那如果能够摆脱所有这些繁琐的步骤，在任意位点切割质粒，然后无缝插入你的靶DNA，会怎么样呢？

南佛罗里达大学Morsani医学院变态反应和免疫学部助理教授王佳望（Jia-Wang Wang，音译）博士说：“我们过去一直在构建一个大尺寸的基因敲入靶载体，最终的步骤是将一个青色荧光蛋白( cyan fluorescent protein , CFP)插入到载体中。由于插入位点没有独特的限制酶位点，我们几次尝试一种连接四个片段的策略，没有取得成功。”

这一克隆困境使得王佳望和研究小组重新思考他们的策略，最终他们转向了另一种基因组工程系统——CRISPR/Cas9。他们在近期发表在《生物技术》（BioTechniques）杂志上的新研究论文中详细描述了这种体外“CRISPR克隆”法。

王佳望说：“我们认为，既然CRISPR/Cas9已被成功应用于编辑许多物种的基因组，应该也可以用作为一种特殊的‘限制性内切酶’来特异地切割DNA进行体外克隆。”

王佳望的克隆方法很简单：他利用了Cas9酶精细的特异性和体内切割能力，将DNA片段克隆到了体外的“挑战性”载体中。以往的体内研究证实，结合单导向RNA (single-guide RNA,sgRNA), Cas9能够以远超限制性内切酶的特异性定点切割DNA。王佳望意识到，如果能够在体外实现这样的特异性切割，再结合一种DNA连接方法，就可以构建出一种强大的、改造和克隆DNA片段的新工具。

为了确定他们的方法的可行性，作者们采用一个22-kb的质粒和针对T3启动子的一条sgRNA进行了测试。他们设计了多个长度不同的sgRNA版本来评估脱靶效应及切割效率（延伸阅读：华裔牛人Nature子刊将CRISPR-Cas9特异性提高25倍）。数据显示，Cas9与一个19-bp的sgRNA一起能够实现有效切割，且没有脱靶效应，证实了这一系统可用于特异的位点切割大型DNA载体实现克隆应用。为了进一步加快和简化克隆过程，作者们随后利用了2009年开发的Gibson assembly方法，将一个DNA片段无缝插入到了CRISPR/Cas9线性化的22-kb大小的质粒中。

王佳望指出，尽管这一技术非常强大，能够有效地应用于大量的载体，那些有兴趣在自己的实验室应用这一技术的研究人员在制备过程中仍然要谨慎剪切这样的大型载体，利用高质量的Cas9酶来获得最佳的结果。

虽然，较为常规的克隆应用可能不需要这种新的“CRISPR克隆”方法，但是显然有些时候你实验室的工具箱中有这样的一项技术会特别的有用。王佳望和合著者指出，当采用诸如细菌人工染色体或腺病毒载体一类的大型载体开展研究，无法进行PCR扩增，想找到独特的酶切位点面对着挑战之时，以CRISPR/Cas9为基础的克隆技术将为急需的DNA克隆提供一条更快、更有效的途经。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文索引：

Wang, J-W., Wang, A., Li K., Wang, B., et al. 2015. CRISPR/Cas9 nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning. BioTechniques 58:161-170. doi 10.2144/000114261.