3篇权威：光激活的CRISPR-Cas9系统

　　

生物通报道：最近，分别在Cell子刊《Chemistry & Biology》、Nature子刊《Nature Chemical Biology》和《Nature Biotechnology》发表的三项研究中，研究人员开发出一种光激活的CRISPR-Cas9系统，能够按需打开和关闭转录。

可以毫不夸张地说，CRISPR-Cas9已经风靡生物技术世界。延伸阅读：PNAS：基于CRISPR的多色荧光标记系统。RNA引导性核酸酶使研究人员能够以单核苷酸分辨率编辑活细胞的基因组，这种技术为基础研究、药物开发与临床应用都带来了希望。

从根本上说，Cas9只是一种RNA 引导的DNA结合蛋白，由一个单导向的RNA指导。通过灭活其核酸酶活性、将蛋白质结合到效应物结构域、并选择适当的引导序列，研究人员可以直接靶定他们感兴趣的基因组区域。

在2013年，多个研究团队将一种催化无效cas9核酸酶结合到转录激活结构域，从而使它们控制内源基因的表达。但这些系统都是组成性的，没有办法打开和关闭转录本。现在，研究人员已经有了解决方法。

分别由东京大学Moritoshi Sato和杜克大学Charles Gersbach带领的两项研究，开发出了基于CRISPR-Cas9的转录激活系统，可以用光进行控制，这两项研究分别发表在Cell旗下子刊《Chemistry & Biology》、Nature旗下子刊《Nature Chemical Biology》。该系统包括一对融合蛋白：一个蛋白把灭活Cas9蛋白结合到一个称为CIb1的蛋白，另外一个蛋白将一个转录激活结构域结合到隐花色素2（CRY2）。用蓝光照亮表达这两个蛋白质的细胞和引导性RNA，可使两个蛋白质片段配对，将转录激活结构域拴在DNA上，并激活转录。本设计为以前这种构成性的合成转录因子引入了一种调控机制。

CIb1和CRY2是植物蛋白。光做出响应，CRY2经历了构象变化，使它与CIB1相互作用。Gersbach解释说：“植物用这个来感知一天的长度。”在2013年，Broad研究所的张锋和他的同事们使用这两种蛋白质，制备了基于转录激活因子样效应物（TALEN）DNA结合结构域的“光诱导转录效应物”（LITE），并用其构建了TALEN基因组编辑酶。但是，定制的DNA结合TALEs比较难以生产，需要蛋白质工程。现在，Gersbach和Sato将这种技术扩展至更简便CRISPR-Cas9系统，可使用很短的RNA进行编程。同时，张锋开发了一种“分裂的Cas9结构”，可允许雷帕霉素诱导的转录激活和基因组编辑。

然而，构建新的光激活系统不只是简单地将TALE结构域与Cas9交换。例如，Sato的团队，检测了CRY2和CIB1融合蛋白的多种结构，发现为TALE起作用的结构并不为Cas9起作用——可能由于后一个蛋白质“更大、更复杂的结构”。Sato说：“这是本系统开发过程中最具挑战性的部分。”

Sato和Gersbach表明，内源性基因可以从时间和空间上进行控制——例如，通过使用光罩来限制培养板特定区域的光照。他们还表明，可以通过打开或关闭蓝光LED而反复地激活转录。研究人员利用CRISPR-Cas9系统的多路复用好处，例如，通过使用每个基因的多个引导RNA，增加转录输出。Sato团队还同时靶定了两个基因。

Sato说：“这种方法可以通过光激活靶向的、用户界定的基因，可以有助于许多生物医学应用，如探索基因的功能，利用它们在体外和体内控制细胞的功能。”

（生物通：王英）

生物通推荐原文：
1. Nihongaki, Y, et al., “CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system,” Chemistry & Biology, 22:169–74, 2015.

2. Polstein, LR, Gersbach, CA, “A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation,” Nat Chem Biol, 11:198–200, 2015.

3. Zetsche, B, et al., “A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation,” Nat Biotechnol, 33:139–42, 2015.