基于CRISPR的诱导性体内基因组编辑

近期在Nature子刊《Nature Biotechnology》发表的一项研究中，来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心、威尔康奈尔医学院等处的研究人员，描述了一种诱导性CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，提供了一种简单的策略，可在不到6个月的时间内制备条件性遗传“缺失”模型，从而为在体内研究基因功能，提供了一个灵活、快速而低成本的平台。

　　

生物通报道：基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑，可让我们对任何基因组位点进行快速的遗传操作，而无需通过同源重组的基因打靶。

我们可以设计CRISPR-Cas9系统，来诱导RNA导向的双链DNA断裂，或利用突变形式的Cas9（Cas9D10A或Casn）诱导单链断裂。CRISPR-Cas9技术已被用来在小鼠基因组中产生可遗传的变化，从而显著降低制备转基因小鼠模型（GEMMs）所需要的时间。然而，纯合胚系突变往往会造成胚胎致死或发育缺陷，而且没有组织特异性，从而限制了这类模型在成年组织基因功能研究中的效用。延伸阅读：PNAS：基于CRISPR的多色荧光标记系统。

近期在Nature子刊《Nature Biotechnology》发表的一项研究中，来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心、威尔康奈尔医学院等处的研究人员，描述了一种条件性转基因方法，可在成年小鼠的诱导性基因组编辑中，对CRISPR-Cas9活性进行时间控制。

在这项研究中，研究人员表明，强力霉素（doxycycline）调控的Cas诱导，能够使我们在多种组织中进行广泛的基因敲除，而且，限制Cas9表达的持续时间，或使用Cas9D10A（Cas9n）变体，可以分别调节靶基因修饰的频率和大小。这项研究的数据表明，强力霉素依赖性Cas9或Cas9n诱导，可在体内诱导靶基因变化，这些变化可概括传统基因敲除方法的影响。

最后，该研究表明，利用成对sgRNAs结合Cas9n，可在体内驱动稳健的功能缺失表型，同时降低脱靶突变形成，从而使其成为应用最为广泛的一种选择系统。虽然这种方法需要每个靶点上有两个sgRNAs的表达，但是c3GIC9n打靶载体可以容纳至少6个U6-sgRNA框架，而没有打靶效率的损失。

当然，越来越多的基因组靶点数，也将增加突变的复杂性和异质性，因此，对靶定多个基因的菌株进行分析，可能是复杂的，最适合于癌症研究，因为在癌症研究中这种变化是正向选择的。不管怎样，诱导性CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，提供了一种简单的策略，可在不到6个月的时间内制备条件性遗传“缺失”模型，从而为在体内研究基因功能，提供了一个灵活、快速而低成本的平台。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9
Abstract: CRISPR-Cas9-based genome editing enables the rapid genetic manipulation of any genomic locus without the need for gene targeting by homologous recombination. Here we describe a conditional transgenic approach that allows temporal control of CRISPR-Cas9 activity for inducible genome editing in adult mice. We show that doxycycline-regulated Cas9 induction enables widespread gene disruption in multiple tissues and that limiting the duration of Cas9 expression or using a Cas9D10A (Cas9n) variant can regulate the frequency and size of target gene modifications, respectively. Further, we show that this inducible CRISPR (iCRISPR) system can be used effectively to create biallelic mutation in multiple target loci and, thus, provides a flexible and fast platform to study loss-of-function phenotypes in vivo.