张锋Nature重大突破：用新型高效Cas9实现基因组编辑

　　

生物通报道  来自哈佛-麻省理工Broad研究所、麻省理工学院和国立卫生研究院国家生物技术信息中心的研究人员，在一项合作研究中发现了一种高效的Cas9核酸酶，攻克了体内基因组编辑面临的一个主要挑战。发表在《自然》（Nature）杂志上的研究结果，预计将有助于CRISPR工具箱更容易地应用于体内实验和治疗用途。

最早在细菌中被发现，CRISPR-Cas9系统能够切割DNA，充当了对抗病毒感染的一个重要防御机制。尽管许多的微生物物种都拥有这一系统，研究人员优先选择改造了来自化脓链球菌的Cas9酶(SpCas9)来改变高等生物的DNA，并已成为一系列高度通用的基因组修饰技术的基础。

要想扰乱成体动物中的基因，必须要利用一些载体将CRISPR-Cas9系统的关键元件导入到细胞中。由于不会引起人类疾病并已在欧洲获得临床监管机构的批准，腺相关病毒(AAV)被视为是最有前景的候选载体之一。然而，AAV微小的负载能力使得同时包装SpCas9酶和其他基因编辑必需的元件进入到单个病毒颗粒中成为一个挑战。

新研究工作介绍了一种来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶(SaCas9)，它比SpCas9小25%，从而为AAV的包装问题提供了一个解决方案。

Broad研究所核心成员、麻省理工学院McGovern脑研究所研究员张锋（Feng Zhang）领导的研究小组，与麻省理工学院教授Phillip Sharp及国家生物技术信息中心的Eugene Koonin合作，着手鉴别出了一种更小的Cas9酶，它既可以复制当前SpCas9系统的效率，并且容许包装到诸如AAV一类的载体中。研究人员一开始利用比较基因组学分析了来自600多种不同类型细菌的Cas9s，选择了6个较小的酶进行进一步研究（延伸阅读：张锋博士Cell：让CRISPR在癌症领域大放异彩 ）。

Koonin说：“通过筛查600个左右可获得的Cas9序列，我们发现了一组酶结构域是完整的，而非酶部分被大大截短的小变异体。幸运的是，其中一个较小的Cas9蛋白被证实适合开发论文描述的这种方法。我们现正在积极地探索Cas9和相关蛋白的多样性，希望能够找到一些有潜力促成更强大工具的新变种。”

经过严格的测试，证实只有来自金黄色葡萄球菌的Cas9在哺乳动物细胞中的DNA切割效率与SpCas9相当。该研究小组随后利用了由卡罗林斯卡学院的Nicola Crosetto和法兰克福歌德大学的Ivan Dikic开发的一种方法BLESS，来确定了整个基因组空间中存在的意外的“脱靶”情况。再一次证实了SaCas9和SpCas9具有相当的DNA靶向精确度。

研究利用AAV/SaCas9介导靶向一种有前景的药物靶点PCSK9，证实了它的体内基因编辑能力。在人体内PCSK9丧失与心血管疾病风险降低及LDL胆固醇水平下降相关联。在小鼠模型中，研究人员观察到给予AAV/SaCas9后一周血液中的PCKS9几乎完全耗尽，总胆固醇下降40%。小鼠未表现出明显的炎症或免疫反应迹象。

研究的共同第一作者Fei Ann Ran说：“尽管我们在这一原理证明研究中选择的是治疗相关靶点PCSK9，我们的更大目标是开发出通用、高效的系统来扩大我们在体内编辑基因组的能力。”

更广泛来说，SaCas9预计将提高科学家们利用动物模型筛查突变效应的能力，更好地了解基因功能。在未来，或许可以改造它来实现靶向基因表达调控，利用它来扩大我们对于细胞中转录和表观遗传调控的认识。

资深作者张锋说，下一步是比较两种Cas9s，希望能够发现一些进一步优化这一系统的方法。

张锋说：“这一研究突显了利用比较基因组分析来扩展CRISPR-Cas9工具箱的能力。我们的长期目标是将CRISPR开发为一种治疗平台。这一新的Cas9为扩大我们的Cas9清单，帮助我们构建出更好的疾病模型，鉴别出一些机制，以及开发出新疗法提供了一个支架。”

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9

The RNA-guided endonuclease Cas9 has emerged as a versatile genome-editing platform. However, the size of the commonly used Cas9 from Streptococcus pyogenes (SpCas9) limits its utility for basic research and therapeutic applications that use the highly versatile adeno-associated virus (AAV) delivery vehicle. Here, we characterize six smaller Cas9 orthologues and show that Cas9 from Staphylococcus aureus (SaCas9) can edit the genome with efficiencies similar to those of SpCas9, while being more than 1 kilobase shorter. We packaged SaCas9 and its single guide RNA expression cassette into a single AAV vector and targeted the cholesterol regulatory gene Pcsk9 in the mouse liver. Within one week of injection, we observed >40% gene modification, accompanied by significant reductions in serum Pcsk9 and total cholesterol levels. We further assess the genome-wide targeting specificity of SaCas9 and SpCas9 using BLESS, and demonstrate that SaCas9-mediated in vivo genome editing has the potential to be efficient and specific.