Cell子刊：酵母中的基因组编辑

　　

生物通报道：最近，在Cell子刊《Cell System》发表的一项研究中，来自美国Amyris Inc的研究人员，在酵母中实现了快速便捷的多点突变和大片段缺失构建。与之前的复杂操作相比，这让酵母中的基因供能研究变得更加快速和高通量化。延伸阅读：基于CRISPR的诱导性体内基因组编辑。

设计微生物用于原材料的工业化生产涉及：设计、构建、测试和学习周期的反复进行。目前，构建阶段（菌株设计）是最占用时间的。迫切需要并行进行这些工程步骤，以加快这一过程。设计的核酸酶可以促进多重整合，RNA引导的CRISPR-Cas系统大大简化了位点特定性限制性内切酶的生产。与异二聚体的TALEN和锌指核酸酶相反，在CRISPR-Cas系统的靶向特异性，是由易于编程的RNA组件所赋予，可通过表达与基因组靶位点互补的短RNA（gRNA）而重定向。

因此，现在利用CRISPR-Cas系统对高等动物进行多重设计的报道有很多。大多数研究使用该系统来诱导断裂，可被非同源末端连接修复，从而导致可变长度的缺失和基因功能的丧失。关于整合功能性遗传结构或将变化精确地引入遗传位点，还很少见报道，部分是由于这些类型细胞中的同源重组率低。相比之下，啤酒酵母（S. cerevisiae）细胞有利于同源重组，从而提出了“将CRISPR-Cas系统应用于更复杂的工程任务”的可能性。

有研究小组在酿酒酵母中，将CRISPR-Cas系统引入一个单点突变或小构造，以破坏三个基因，并将基因变体库整合在一个单一位点。该技术也适用于裂殖酵母，但据我们所知，还没有应用到其他工业相关酵母的报道，例如克鲁氏乳酸酵母等。目前报道的程序具有很高的效率，但是要求选择所有的CRISPR-Cas元件，这通过为每个靶向位点新组合克隆一个复杂的表达质粒而得以实现。这一要求限制了这些方法的灵活性。

在这项研究中，研究人员使用一种模块化的gRNA传递策略，来实现点突变的多元整合，包括在三个位点同时引入五个精确修改，以赋予菌株增强的耐醇性。

研究人员表明，一个单一线性化质粒（携带多重PCR生产的引导RNA和供体DNA盒）的共转化，可促进点突变和大片段缺失构建的高效集成。这种技术可让研究人员以64%的效率，恢复无标记的三重工程事件，而不需要选择所有gRNA的表达。gRNA盒可以通过PCR很容易地产生，并在任何组合中传递。

研究人员用这种方法快速制备了五个特定的等位基因组合，并确定了协同效应。为了制备粘康酸的生产途径，研究人员将6个DNA片段（共24kb）整合入原始态酿酒酵母中的三个位点中（在一次单一转化中）。利用微小的改装，研究人员在乳酸克鲁维酵母中集成了一个类似的途径。组合的gRNA传递所提供的灵活性，大大加速了用于基础研究和工业发酵的复杂菌株的设计。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Efficient Multiplexed Integration of Synergistic Alleles and Metabolic Pathways in Yeasts via CRISPR-Cas
Summary: CRISPR-Cas genome engineering in yeast has relied on preparation of complex expression plasmids for multiplexed gene knockouts and point mutations. Here we show that co-transformation of a single linearized plasmid with multiple PCR-generated guide RNA (gRNA) and donor DNA cassettes facilitates high-efficiency multiplexed integration of point mutations and large constructs. This technique allowed recovery of marker-less triple-engineering events with 64% efficiency without selection for expression of all gRNAs. The gRNA cassettes can be easily made by PCR and delivered in any combination. We employed this method to rapidly phenotype up to five specific allele combinations and identify synergistic effects. To prototype a pathway for the production of muconic acid, we integrated six DNA fragments totaling 24 kb across three loci in naive Saccharomyces cerevisiae in a single transformation. With minor modifications, we integrated a similar pathway in Kluyveromyces lactis. The flexibility afforded by combinatorial gRNA delivery dramatically accelerates complex strain engineering for basic research and industrial fermentation.