CRISPR操作指南进阶版：如何精确有效完成实验

我们需要更加精确和有效的CRISPR工具，研究人员也正在研究如何避免错误情况的发生，开发更好的预测编辑工具，或者研发能将CRISPR元件更有效传递到细胞内的方式。

　　生物通报道：生物学家们总是沉迷于对基因组修修补补，而其中一种近期红得发紫的技术就是 CRISPR。自2012年CRISPR/Cas 首次作为一种基因组编辑工具登台以来，关于这种技术的论文数量就大幅增加，最好的证明之一就是2015年两位科学家由于在CRISPR基因组编辑技术方面的重要贡献而获得“科学突破奖”，其中一位获奖者：Jennifer Doudna 最近在范德堡大学进行客座演讲，主会场和分会场都挤满了人，从中可以窥见这一技术的火热程度。

CRISPR全称为clustered regularly interspersed short palindromic repeats，是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统，它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。直到近年，科学家们才开始利用这一系统在活体动物基因组中生成靶向突变，删除原有的基因或插入新基因。

这一技术发展迅速，就在去年，研究人员已经发现了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一种罕见肝脏疾病的方法，并且科学家们也发现可以通过这种方法切除人类免疫细胞中HIV病毒插入的基因，阻止HIV进入血液干细胞。其原因可能在于这种方法比其它基于核酸酶的编辑方法操作简便，研究人员跟着指南操作，进行一轮PCR就能基本完成CRISPR实验了。

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但CRISPR/Cas系统也存在自身的一些缺陷，比如进入细胞后，有可能在非目标位点进行酶切，从而导致脱靶，这对于临床应用来说是一大败笔。

我们需要更加精确和有效的CRISPR工具，研究人员也正在研究如何避免这类情况的发生，开发更好的预测编辑工具，或者研发能将CRISPR元件更有效传递到细胞内的方式，以下是The Scientist杂志汇总的新进展。

癌症研究的启示

研究者：康奈尔大学遗传学教授John Schimenti

项目：利用 CRISPR/Cas9 研发癌症和减数分裂小鼠模型

CRISPR/Cas9系统是通过在基因组上造成切口来完成编辑工作，这些切口可以通过两种途径修复，一种是由非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 过程进行粘合，这种方法有效但容易出错；另外一种方法就是加入包含精确目标突变的DNA人工片段，利用同源指导修复（homology-directed repair，HDR，生物通译）完成。

Schimenti 说，“问题在于这两个过程是竞争完成的。前者NHEJ会由于实验小鼠出现非目标突变受到干扰，”他们希望能找到一种HDR途径新方法完成有效，且更精确的编辑，

为了解决这一问题，研究人员尝试针对过去的果蝇胚胎基因组编辑实验改进 HDR/NHEJ 比例，他们通过遗传手段抑制了NHEJ途径中的一个分子：DNA连接酶IV，碰巧正好有这么一个小分子抑制剂，SCR7能抑制这种酶的作用（这种小分子在之后的实验中被证明能作为癌症治疗分子）。

Schimenti研究组在小鼠胚胎中改变了一个基因的两个碱基，结果证明加入SCR7能将HDR:NHEJ比率从之前的1:10调整为1:2.5，这一研究成果公布在今年的Genetics杂志上，标题为A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications。

如何操作：

只要在Cas9 和合成的DNA 被注入到你的单细胞受精卵之后，在培养基中添加 SCR7就可以了。一些其他的研究组，如范德堡大学的Douglas Mortlock也在尝试进行这一实验。Schimenti实验室常会在实验中加入这种物质，因为目前看来SCR7并不会造成什么伤害，不过“这种小分子确实会影响其它基因，所以还是需要进行对比实验，”他说。

注意事项：

培养基中加入了SCR7（50 μ M）的受精卵生存率更高，但是在two-cell阶段，SCR7 会影响细胞进入囊胚期，其原因尚不清楚。但Schimenti表示这应该不成问题，因为在那之前就可以将其转入到雌性小鼠中了。

成本：从Xcessbio公司可以买到SCR7，价格为129 美元/2 mg（当地价格）。