荧光VS发光，哪种报告基因更适合你

生物通报道：报告基因可以让目标分子像黑暗中的萤火虫那样鲜明出众，帮助研究者们检测蛋白和核酸的定位、互作和活性。

报告基因一般分为荧光报告基因和发光报告基因两种类型，发光报告基因包括了化学发光和生物发光。那么荧光报告基因和发光报告基因孰优孰劣呢？不少刚刚接触报告基因系统的研究者可能会对此感到疑惑。这篇文章提供了一些可供参考的指导方针。

何时选择荧光报告基因

在选择报告基因时，我们首先需要考虑的因素是研究目的。如果你想要在体外培养的细胞中研究蛋白定位，“就应该选择荧光报告基因，”Promega公司的资深战略营销经理Kevin Kopish说。“荧光报告基因主要用于研究蛋白质的动态”，而化学发光报告基因一般用于基因调控研究。（延伸阅读：Cell：更明亮的蛋白标记系统）

在进行多重分析时，人们通常选择荧光报告基因。“选择可以兼容的荧光蛋白或者改变标记蛋白的荧光基团，就可以实现多重的报告体系，”Kopish说。在一些常见的应用中（比如显微镜检测、流式细胞分析和荧光激活的细胞分选），荧光报告基因的多重化能力特别有帮助。而化学发光信号更适合进行群体检测，比如WB、活体成像和多孔板分析。

荧光报告系统非常量，因此最好在多重化的时候将亮度与目标丰度匹配起来，比如对较弱的信号用更亮的染料，Thermo Fisher的资深产品经理Brian Almond说。另外，还要确保荧光之间有足够明显的颜色区别，“在同一个样本中监控几种不同颜色的荧光标记，可以获得意义更加丰富的实验结果，”Almond说。

荧光报告基因也可以用来评估分子间的相互作用，比如荧光共振能量转移及其衍生技术。在邻位连接分析中（比如Sigma-Aldrich的Duolink® assay），两个目标蛋白彼此靠近的时候就会出现荧光。“这种情况只能使用荧光（不能用化学发光）报告基因，因为发光报告基因并适合邻位连接分析所用的显微镜相机，” Sigma-Aldrich公司的应用科学家Carol Kreader说。

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何时选择发光报告基因

人们在进行基因表达分析时常会选择化学发光，Kopish说。一个常见例子是，将起调控作用的启动子与荧光素酶配对，然后根据蛋白提取物的荧光强度评估启动子的活性。化学发光报告基因主要用于检测细胞群体的信号（比如微孔板的一个孔），而不是单个细胞。“化学发光（包括生物发光）一般局限于全孔分析，”Kopish说。“更适合作为一种定量工具。”

 

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Sigma的microRNA 检测系统（MISSION® 3’UTR Lenti GoClone™ system）就用到了这种定量发光工具，Kreader说。“他们将LightSwitch萤光素酶融合到数千种miRNA的3’非翻译区。如果miRNA结合，发光信号就会减弱。”这一系统主要用于验证miRNA靶标和研究转录后的基因调控。

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除了定量分析以外，发光报告基因还有其他的优势，比如灵敏度高而且背景低。一些生物分子在受到激发时会发出荧光，这种非特异性的自发荧光会干扰荧光报告基因，Almond说。化学发光报告基因“几乎没有背景”，研究者通常在需要扩大信号或者减少背景信号的时候使用它。“化学发光报告基因很适合Western分析和ELISA应用，”Almond说。

因为背景较低，化学发光信号也适合用于组织和小型动物的活体研究，比如进行全身成像。“发光报告基因在动物体内的使用非常成功，这也是因为它们非常灵敏，”Kopish说。“荧光报告基因在动物体内用得不太好，因为光散射、光吸收以及自身荧光会造成很高的背景信号。”

界限开始模糊

Promega公司最近推出的NanoLuc®萤光素酶突破了两类报告基因之间的界限。NanoLuc比其他荧光素酶小，活性比其他荧光素酶高，能生成很强的信号。“NanoLuc的高活性突破了发光报告基因的界限，”Kopish说。“我们既可以通过显微镜检测融合蛋白的定位，也可以进行高通量的群体分析（全孔）。

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NanoLuc技术允许研究者用发光报告基因同时研究两种蛋白，甚至还能分析分子间的互作，涉足荧光报告基因的领地。据Kopish介绍，Promega准备在三月份发布双荧光素酶分析新产品。该产品使用NanoLuc和萤火虫荧光素酶两种报告基因，可以通过生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer ）检测分子互作。“这一技术可以检测蛋白质互作而且相当灵敏，允许我们把蛋白表达控制在内源蛋白的水平上。”

这个新报告基因的还可以用于基因表达。Promega最近与Horizon Discovery合作，将NanoLuc整合到以CRISPR/Cas9为基础的基因工程体系中。研究者可以用NanoLuc替换一个等位基因或者插入NanoLuc建立融合蛋白，然后进行报告基因分析。“这样的报告基因研究有正确的染色质环境，受到基因表达调控子的影响，”Kopish说。“而且标签蛋白不会出现人为造成的过表达。”

 

（Caitlin Smith撰写/叶予编译）