用CRISPR/cas9编辑精原细胞基因

　　

生物通报道：利用CRISPR/Cas9 系统对胚胎进行基因编辑，可有效地产生具有靶向基因组修饰的生物体。三月十二日在Cell子刊《Cell Reports》发表的一项研究中，来自德克萨斯大学西南医学中心、芝加哥大学和犹他大学等处的研究人员，用CRISPR / cas9技术对大鼠的精原细胞进行基因编辑，为在大鼠中产生靶向胚系突变以及研究精子发生，提供了一个平台。延伸阅读：确定新致癌基因的高效CRISPR/Cas9平台。

CRISPR/cas9 RNA引导的DNA内切酶技术被广泛用来在不同类型细胞和生物体中生成靶向基因突变，以研究它们的生物学过程。在哺乳动物中，用CRISPR / cas9进行的基因编辑，在啮齿类动物、猪、山羊和猴子中产生了高比率的供体-胚胎衍生后代，它们都具有靶向基因突变。向小鼠注射表达gRNAs和cas9（可直接裂解供体受精卵中的靶向基因序列）的结构后不到一个月，就可以产生变异的小鼠。CRISPR /cas9非常有效，在通过共注射具有gRNAs的受精卵而产生的动物中，多个靶基因的两个等位基因都被破坏。

CRISPR/cas9在动物中也能有效地促进靶等位基因镶嵌性，这表明，随着全能性受精卵经历胚胎植入前的发育，早期胚胎卵裂阶段发生了独立的基因编辑活动。CRISPR/cas9通常在胎龄（E）0.5天到E1被传递到哺乳动物受精卵。例如，在E6到E6.5之间，小鼠生殖细胞分化成一小部分外胚层细胞（10到20个近端外胚层细胞）。

这就解释了为什么在第一代突变体动物组织中观察到CRISPR / cas9靶等位基因镶嵌性，为什么身体组织中的靶等位基因不同于生殖细胞。镶嵌体动物中的靶等位基因异质性必须通过远交才会产生纯的、无镶嵌性的种系突变基因。通过实验性地远交等位基因镶嵌体来挑选新的突变，在啮齿类动物中需要花几个月，在一些物种中，由于更长的生命周期和/或低繁殖力，还需要更长的时间。

当宿主胚胎是用CRISPR / cas9转基因多能干细胞重建时，也会产生靶等位基因镶嵌性。正如早期胚胎，CRISPR / cas9可能明显地修改干细胞克隆中的多个靶基因（当细胞分裂时）。除了这种变化，用多能性供体细胞重建的野生型囊胚，可进一步产生“镶嵌性”动物，它们的器官系统和生殖细胞是由供体和受体胚胎细胞混合物发育而来。

当把CRISPR / cas9修改的无性系富集供体细胞，通过体细胞核移植到无核卵母细胞中，从而产生猪和羊的时候，镶嵌和嵌合现象大幅减少。用预筛选重建四倍体胚胎，也可以预测无性繁殖扩增的多能细胞系，以最小化外胚层来源组织中的镶嵌性和嵌合性。或者，直接在供体精子发生干细胞中编辑生殖细胞，可避免胚胎发育的全能性和多能性状态，从而消除了镶嵌/嵌合突变体后代的生产。

在这项研究中，为了促进大鼠的生殖细胞编辑，研究人员使用CRISPR/Cas9来促进大鼠培养精原干细胞中的靶向基因组突变。CRISPR/Cas9修改的精原细胞可再生精子发生，并在移植到大鼠睾丸之后表现出长期的精子形成潜力。Epsti1和Erbb3中的靶向生殖系突变，被垂直地从受体进行传递，仅产生纯的、无嵌合性的突变后代。产生的Epsti1突变大鼠，没有或者有供体精原细胞的遗传选择。Erbb3无效种系的单克隆富集，揭露了培养细胞中的隐性精子形成存在缺陷，产生了靶等位基因同基因型的突变后代。

总而言之，用CRISPR / cas9进行的精原细胞基因编辑，为在大鼠中产生靶向胚系突变以及研究精子发生，提供了一个平台。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Targeted Germline Modifications in Rats Using CRISPR/Cas9 and Spermatogonial Stem Cells
Summary: Organisms with targeted genomic modifications are efficiently produced by gene editing in embryos using CRISPR/Cas9 RNA-guided DNA endonuclease. Here, to facilitate germline editing in rats, we used CRISPR/Cas9 to catalyze targeted genomic mutations in rat spermatogonial stem cell cultures. CRISPR/Cas9-modified spermatogonia regenerated spermatogenesis and displayed long-term sperm-forming potential following transplantation into rat testes. Targeted germline mutations in Epsti1 and Erbb3 were vertically transmitted from recipients to exclusively generate “pure,” non-mosaic mutant progeny. Epsti1 mutant rats were produced with or without genetic selection of donor spermatogonia. Monoclonal enrichment of Erbb3 null germlines unmasked recessive spermatogenesis defects in culture that were buffered in recipients, yielding mutant progeny isogenic at targeted alleles. Thus, spermatogonial gene editing with CRISPR/Cas9 provided a platform for generating targeted germline mutations in rats and for studying spermatogenesis.