CRISPR专家发表CRISPR/Cas9综述

CRISPR技术的确在科学界掀起了基因组编辑的狂潮。最近，来自美国加州大学伯克利分校和布罗德研究院的CRISPR专家John Doench和Ella Hartenian在国际知名学术期刊《FEBS J》发表题为“Genetic screens and functional genomics with CRISPR/Cas9 technology”的综述文章。

　　

生物通报道：CRISPR技术的确在科学界掀起了基因组编辑的狂潮。在Pubmed中快速检索“CRISPR”，目前已有1400多项结果。也相继有专家为该技术撰写了综述论文，例如：Science综述：CRISPR-Cas9系统的历史和未来；北大魏文胜最新发表CRISPR综述。

最近，来自美国加州大学伯克利分校和布罗德研究院的CRISPR专家John Doench和Ella Hartenian在国际知名学术期刊《FEBS J》发表题为“Genetic screens and functional genomics with CRISPR/Cas9 technology”的综述文章。

在这篇综述中，两位专家首先简要总结了CRISPR/Cas9的发现和特征，然后将这一技术与其他的基因组工程技术进行了比较。

该综述讨论了这一技术在遗传筛选中的首次应用，回顾了以前用于功能性遗传筛选的几种技术，以及这些技术进行遗传筛选所存在的问题。然后作者介绍了将CRISPR技术用于遗传筛选的几项报道，着重关注如何优化精确打靶活性，减少该技术中存在的脱靶效应。

重要的是，这篇论文对CRISPR技术的未来挑战和机遇进行了评论。作者认为，在过去几年当中，利用CRISPR技术所取得的进步是令人惊讶的，但是未来还存在着许多机遇和挑战。例如，来自化脓性链球菌（S. pyogenes）的Cas9是研究的第一种Cas酶，并将继续被广泛使用。而研究人员也将开始探索来自于其他物种的Cas9蛋白，有几千种Cas9蛋白质是原核生物内生性的，可能更适合于不同的研究目的。化脓性链球菌Cas9很大，因此很难被有效地包装进众多病毒载体。更小的Cas蛋白已有描述，但是不能被完全开发以广泛用于遗传筛选和常规基因组编辑。

作者还指出，CRISPR系统的RNA成分也值得进一步完善。通过产生更大的数据集和更强的建模技术，研究人员将继续设计优化各种sgRNA序列，以提高精准打靶活性，并避免脱靶效应。

尽管产生位点特异性dsDNA断裂有所改善（先是用ZFNs，然后是TALENs，现在是用Cas9），但是外源性提供的DNA序列的位点特异性集成，在许多细胞类型中仍然是一个效率高度低下的过程。而且，全基因组关联研究的大多数显著相关性，存在于基因组的非蛋白质编码区，因此内源性位点的基因编辑，是充分了解特定变体如何影响细胞状态的唯一方法。当前的方法，通过分析数百个单细胞分离体来寻找一个成功编辑的克隆，并不能很好的扩展到高通量。

最后，作者还提出了改进这一技术的几种可能性。例如，通过siRNA为基础的关键组件敲除抑制非同源末端连接（NHEJ）率，可能创建一个临时窗口，在这个窗口中同源重组是受青睐的修复路径。加强被编辑细胞的检测也是一种可能性，当前的标准方法要求细胞被溶解，以通过核酸内切酶或测序为基础的分析来检测编辑事件，从而要求细胞的预先扩增和复制，为了恢复活克隆的事后检测，往往以多孔板的分析形式。以混合模式检测特异序列的能力，例如通过使核酸酶失活的Cas9与扩增的荧光信号结合，将使我们能够使用流式细胞技术富集成功被编辑的细胞。最后，基于模板的修复，也可以通过将邻近的修复模板带到修复部位而得以改进，而不是目前在细胞中随机扩散的方法。这些方法和其他方法，将是实现基因组编辑实验大规模应用所必需的。

总而言之，CRISPR是第一个基因组编辑技术，可以很容易地通过使用廉价的、易于组装的试剂在任何实验室中进行操作，从而使得基因组编辑过程更加大众化。虽然我们处于CRISPR技术的鼎盛时期，但是，对于充分了解这一系统并扩大其潜在应用来说，我们还处于早期阶段。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Genetic screens and functional genomics with CRISPR/Cas9 technology
Abstract: Functional genomics attempts to understand the genome by perturbing the flow of information from DNA to RNA to protein in order to learn how gene dysfunction leads to disease. CRISPR/Cas9 technology represents the newest tool in the geneticist's toolbox, both allowing researchers to edit DNA with unprecedented ease, speed, and accuracy, and representing a novel means to conduct genome-wide genetic screens to discover gene function. In this review we first briefly summarize the discovery and characterization of CRISPR/Cas9, and then compare it to other genome engineering technologies. We discuss its initial use in screening applications with a focus on optimizing on-target activity and minimizing off-target effects. Finally, we comment on future challenges and opportunities with this technology. This article is protected by copyright. All rights reserved.