全新的蛋白相互作用分析工具：NanoBRET™ 技术[新品推荐]

在细胞中，蛋白质并不是孤单的个体。大多数蛋白通过与分子伴侣或其他蛋白形成复合物而发挥其功能。因此，在了解细胞的生物学特性时，蛋白质相互作用（PPI）研究就成了重要一环。在药物开发的过程中，这一信息也至关重要，有助于确认药物靶点。

一提起蛋白质相互作用研究，你的脑海中可能马上浮现出：酵母双杂交、免疫共沉淀等技术。的确，这些都是经典方法，可有效检测体内体外蛋白质相互作用。然而，它们不能提供动态的蛋白相互作用信息，似乎还缺乏一些说服力。基于此，共振能量转移这种方法受到人们的青睐。这种能量转移有着严格的距离限制（< 10 nm），特别适合评估蛋白质的相互作用。

它的原理并不复杂，就是两个蛋白分子靠近时，激发态能量从一个荧光基团转移到另一个。生物发光共振能量转移（BRET）和荧光共振能量转移（FRET）都属于这种方法。它们的主要区别在于，FRET涉及到两个荧光基团之间的能量转移，其中一个需要适当光源的外部激发，而BRET在底物被氧化之后发生，因此不需要外部激发。如此看来，BRET相对FRET有不少优点，比如无需激发光，背景更低，也避免了光漂白和自发荧光等问题。

BRET最初是在海洋生物中观察到的，如水母和海肾。之后，人们将其用于动物和植物研究。在BRET技术中，蛋白A融合萤光素酶（通常是海肾萤光素酶），作为能量供体，蛋白B则融合带有荧光基团的标签蛋白，作为能量受体。如果蛋白A和B存在相互作用，加入萤光素酶底物后，萤光素酶发光可以激发邻近的蛋白B的荧光基团发光。如果没有相互作用，那就没有荧光咯。

大幅改良的BRET平台

目前，人们大多使用海肾萤光素酶（Rluc）作为能量供体，黄色荧光蛋白（YFP）作为能量受体，在这之间实现能量转移。然而，Rluc和YFP的光谱接近，产生了明显的背景。这种高背景增加了检测噪音，也降低了灵敏度和动态范围。

于是，Promega对BRET方法进行大幅改良。它使用NanoLuc® 萤光素酶作为能量供体，而HaloTag® 蛋白标记的NanoBRET™ 618荧光基团作为能量受体，带来了最新的NanoBRET™ 技术。

集两大专利于一身的NanoBRET™，可不是闹着玩的。NanoLuc® 萤光素酶的分子量仅为19 kDa（171个氨基酸），更适合于构建融合蛋白。别看它小，它的光信号比海肾萤光素酶高两个数量级，因此极少量也能准确定量，特别适合细胞水平蛋白相互作用的研究。

至于能量受体，Promega利用HaloTag® 蛋白标签技术来构建。在评估了一系列荧光基团之后，他们选择了NanoBRET™ 618配基。它与NanoLuc® 的波长配对更加，使得检测数据更加出众。于是，来自NanoLuc® 供体的明亮的蓝移发光信号耦合到远红移的HaloTag® 受体上后，光谱叠加更佳、信号更强、且与传统的BRET分析相比背景更低。

如何构建载体？

也许你接着要问，NanoBRET™ 性能不错，但操作起来会不会很麻烦。如果你想省时省力，可以选择预构建载体。NanoBRET™ 预构建载体融合了已知相互作用的蛋白的基因，无需你再自行构建载体，可直接用于转染，进行药物作用机理及其他相关的机制研究。

Promega目前提供了许多经过优化的NanoBRET™ 检测，包括表观遗传学检测，可研究溴结构域（bromodomain）与组蛋白的相互作用。此外，转录蛋白、信号蛋白和膜蛋白等方面也有不少产品，具体可登陆Promega的网站查询（www.promega.com）。

如果这其中没有你的研究目标，也不必遗憾，自行构建就是了。相信对大家来说，这种克隆是so easy，况且Promega也提供了方便的Flexi 载体克隆系统。这是一种定向克隆技术，基于两个稀有酶切位点的限制性内切酶，SgfI和PmeI。它能够快速、高效、高保真性地在不同 Flexi 载体间转移蛋白编码区，而无需重新测序。

NanoBRET™ PPI Flexi Starter System 就以Flexi 载体为基础，提供了蛋白相互作用检测的解决方案，包括载体，检测试剂及阳性对照。这个过程很简单，就是经典的酶切连接过程，也不需要构建入门载体。由于载体本身在SgfI和PmeI酶切位点之间是一个致死基因，这使得阳性克隆的几率大大增加，但也带来载体保存的问题。我们无法复制，只能每次向厂家购买。

当然，你也可以选择另一个常规方案，利用多克隆位点（MCS）来克隆。Promega的NanoBRET™ PPI MCS Starter System提供带有多克隆位点的NanoLuc® 融合蛋白克隆载体和HaloTag® 融合蛋白载体，以及检测试剂和阳性对照。这些组分也可以单独购买。

别人怎么用？

研究人员已经利用NanoBRET™ 技术发表了不少文章。今年1月，清华大学和宾夕法尼亚大学的研究人员在研究Rabin8的蛋白构象是否起着自抑制作用时，就使用了NanoBRET™ 技术1。

Rab蛋白是Ras超家族中的一类，也是一类低分子量的GTP结合蛋白（大约20-29 kDa），它们负责调控真核细胞的囊泡运输等过程。其中，Rab8是胞吐作用的一个关键调控因子。Rabin8是一种鸟苷酸交换因子（GEF），也是Rab8的主要激活因子。

在这项研究中，研究人员构建了Rabin8重组体，在N端融合NanoLuc® 萤光素酶，C端融合HaloTag® 蛋白，这样他们就能利用BRET作为蛋白构象的指示剂。同时，他们采用突触融合蛋白-4（syntaxin-4）重组体作为阳性对照。之后在大肠杆菌中表达两个重组体，并加入NanoBRET™ Nano-Glo® 底物，测定荧光。

通过比较Rabin8和Rabin8突变体的信号，研究人员确定磷酸化作用是Rabin8激活的一个重要机制。他们证实了Rabin8是ERK1/2响应EGF信号的一个直接磷酸化作用底物。在分子水平上，ERK1/2磷酸化Rabin8减轻了它的自抑制，由此促进了Rabin8的GEF活性。这项研究确定了Rabin8激活的一种分子机制。

关于NanoBRET™ 技术的更多文献，以及详细资料和报价，请点击此处向Promega索取。（生物通 余亮）

参考文献：

1. Juanfei Wang, Jinqi Ren, Bin Wu, et al., Activation of Rab8 guanine nucleotide exchange factor Rabin8 by ERK1/2 in response to EGF signaling, PNAS, 2015 112(1):148-53.