专访江小龙：3项新技术+反复枯燥的实验=里程碑式成果

　　

生物通报道：穷其一生我们大多数人都在渴望突破，但突破就像喵星人的尾巴，在追逐的过程中令人筋疲力竭，找到好的方法可能会事半功倍，那么要想获得一份科学突破，是百分之九十九的汗水更重要，还是百分之一的灵感更重要呢？也许每个人都有自己的答案，但对于贝勒医学院的江小龙博士来说，应该两者都很重要。

   上个月江博士研究组公布了一项具有里程碑意义的成果：绘制了迄今为止最为详尽的大脑连接图谱。他们详细地分析了超过2000个成年小鼠视觉皮层神经元的形态和电生理特征，同时也测试了这些细胞间超过11000对连接可能性。这种详细的神经连接图谱对于今后大量神经疾病和精神疾病的研究意义重大。

   这一研究成果公布在Science杂志上，同领域学者不仅对研究成果表示惊叹：“这里的每个实验数据和分析内容都是令人印象深刻的杰作”，而且也折服于其实验工作量：“这项研究的工作量令人惊叹”。为此生物通特联系了江小龙博士，就这项重要成果的方方面面请教了他。

神经图谱研究困难重重

   早在19世纪，科学家就意识到大脑皮层是一个分层结构，六个层次中每一层的神经细胞类型和连接方式都不尽相同。而一旦了解了整个大脑皮层的连接图谱，科学家就有可能更精确地将大脑解剖学、遗传学和相关疾病联系起来研究，意义十分重大。

   然而时至今日，绘制大脑皮层的神经连接图谱依然只停留在初步阶段，就是对皮层的微神经网络，我们对它的连接方式也知之甚少。这主要是因为现有一些经典方法的固有局限性。首先由于很难获取高质量的成年动物大脑组织切片，因此成年小鼠的大脑神经元研究一直受阻；其次，经典分析技术膜片钳一般仅局限于记录单个细胞的电活动，最多同时记录两个神经细胞；此外还有一些分类方法不能充分区分某些抑制性神经细胞，造成神经元分类无法实现。

三项最新技术

   为了解决这些问题，来自贝勒医学院，德国蒂宾根大学等处的研究人员做了许多尝试与优化，他们优化了已有关于成年脑组织样品切片和准备的实验操作过程，确保可大规模记录真实可靠的成年动物的电生理数据。然后按下电位记录同时检测每个大脑切片中8个细胞，这种技术也就是八倍全细胞记录（octuple whole-cell recording）。最后研究组将中间神经元染色，揭示了这些神经元的分枝轴突和树突形态。

   “总体来说，我们之所以能够让这项研究可行，主要采用了三种最近研发的技术，”江博士说，“其中包括：

   制备成年动物脑片的技术：MIT的一个研究组最近报道他们发展了一种新的制备成年动物脑片的技术，可以极大的提高脑细胞在脑片中的存活率。我们采用了并优化了他们的配方，制备出高质量的成年动物脑片；

   多通道同时记录的膜片钳技术：膜片钳技术是一项在上世纪70年代发明，并于90年代获得诺贝尔奖的技术。这项技术主要用来高分辨率地记录细胞跨膜的微小电活动，一般仅局限于记录单个细胞的电活动，最多同时记录两个神经细胞。这些年我们已经研发出可以同时记录8-12 神经细胞的技术。这项技术的优势是可以高效的研究各个神经细胞之间是如何连接的。我们在高质量的成年动物脑片运用这项核心技术，使得我们能够在世界上第一次进行这项大规模的成年动物脑的神经网络研究；

   高质量的细胞染色技术：我们研发出一种可以高质量显示神经细胞的完整形态结构的染色技术，这项技术允许我们根据神经细胞的完整形态结构来进行细胞分类。”

   为了能了解这些细胞的形态，江博士花费了许多时间，在显微镜下进行手工操作，“每次实验我们只能获取最多8-12的细胞，详细分析他们的各种特性。为了找到一些小样本的细胞种类，必须不停的重复实验，记录大量的细胞。实验非常枯燥。”

最为详尽的大脑连接图谱

   神经细胞可以归类为两大类：兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞（也叫中间神经元）。兴奋性神经细胞比较相似，而抑制性神经细胞非常多样性。怎样把多样性的抑制性神经细胞有效的分类一直是神经科学的一个难题。

   根据这些细胞的形态结构特征和电生理性质，研究人员发现了15种不同的中间神经元类型，其中许多都是之前未曾发现的。这些神经元中有些具有不同于之前大脑研究发现神经元类型的特征，研究人员认为这也许是随着年龄增长而出现的新型神经元。

   江博士解释道，“先前采用的一些分类方法 （比如表达特异性生物分子标记物）显得太粗糙，并不能充分地区分某些抑制性神经细胞。在这个研究中，我们把抑制性神经细胞所有特性（包括生物分子标记物，细微组织结构， 电生理特性）都考虑进去，运用一种当前最综合的分类方法，发现抑制性神经细胞的种类远比先前知道的更多。比如就我们研究的皮质细胞层来说，一共有15类抑制性神经细胞。很多种类以前从来没有被报道和描述过。这意味着神经细胞的分类必须采用最综合的分类方法才能真正的区分高度多样性的抑制性神经细胞。”

   更重要的是，这15类抑制性神经细胞都有它们固有的连接模式。根据他们的连接方式，这些中间神经元种类可分成三个组群：作为“主体”的中间神经元（投射支配周围几乎所有神经元）、只投射支配其它中间神经元的中间神经元、投射支配锥体神经元和他们自己的中间神经元。

   同时，研究组成员还分析了神经元之间的1680种神经连接，通过分析这众多的模式，研究人员发现神经元之间的连接可能性在水平方向要比垂直方向上下降的更快。从多个方面来看，这项研究毫无疑问为科学家们破译哺乳动物大脑皮层的复杂性提供了更进一步的信息资料。

   这项研究是这些年第一次在成年动物大脑上做的大规模功能研究。研究发现成年动物大脑在很多方面的确和已报道的幼年动物脑不一样。

   江博士解释说，“离体脑片膜片钳技术是一项脑研究的经典方法。然而，这些技术有一个很大的局限性，那就是只能运用到耐缺氧能力较强的幼年动物的脑组织上。如果用标准的制备方法，人们很难利用成年动物的脑组织制备出高质量的脑片。因而运用膜片钳技术在成年动物脑片上研究大脑功能非常难，这样的研究在过去的几十年少之又少。”

是否可以应用于疾病分析与人脑
 
   这项研究对今后大量神经疾病和精神疾病的研究具有里程碑式的意义。先前的研究已经提示神经疾病和精神系列疾病归根结底是因为神经细胞之间连接出错。尽管先前大量的研究已经找到各个疾病的病因，但这些病因如何导致神经细胞之间出现连接错误，以及是哪些神经细胞连接出错，对这些问题大家还不是十分清楚。

   “我们的研究提供了一个正常动物神经细胞之间连接模式的模板。如果利用疾病的动物模型来对照这个模板，将来的研究应该可以找到每个疾病特有的连接出错，从而为开发出更有效的治疗模式提供一个途径”，江博士说。

   那么未来这项研究是否可以应用于人脑呢？

   对于这个问题，江博士审慎的回答道，“对所获得的结果是否可以用于人类，我们目前还不敢轻易下结论，毕竟没人知道人脑和小鼠脑的异同点，但我们相信一定有相似的地方。更重要是，我们的方法和研究模式完全可以用于人脑。”

   “下一步我们将会把当前的研究扩展到所有的皮层细胞层（包括4 和6 层），建立完整的皮层微神经回路的连接图谱，或者尝试将这一方法用在疾病动物模型上，当前主要集中在研究癫痫和自闭症上，以及尝试把我们的方法用在灵长类的皮层上，建立完整的灵长类皮层微神经回路的连接图谱。”

作者简介：
江小龙，1998毕业于浙江大学医学院。2007年于美国国防医科大学获得神经科学的博士学位。现供职于美国休斯顿贝勒医学院神经科学系。

（生物通：王蕾）

原文摘要：
Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex
Since the work of Ramón y Cajal in the late 19th and early 20th centuries, neuroscientists have speculated that a complete understanding of neuronal cell types and their connections is key to explaining complex brain functions. However, a complete census of the constituent cell types and their wiring diagram in mature neocortex remains elusive. By combining octuple whole-cell recordings with an optimized avidin-biotin-peroxidase staining technique, we carried out a morphological and electrophysiological census of neuronal types in layers 1, 2/3, and 5 of mature neocortex and mapped the connectivity between more than 11,000 pairs of identified neurons. We categorized 15 types of interneurons, and each exhibited a characteristic pattern of connectivity with other interneuron types and pyramidal cells. The essential connectivity structure of the neocortical microcircuit could be captured by only a few connectivity motifs.