Nature：揭示CRISPR/Cas9的DNA靶向切割机制

　　

生物通报道   来自加州大学伯克利分校的研究人员揭示出，Cas9 的HNH核酸酶结构域构象状态直接控制了DNA切割活性。这一研究发现发布在10月28日的《自然》（Nature）杂志上。

领导这一研究的是加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna博士。Doudna是CRISPR技术的共同开发者，曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”（Breakthrough Prize），是CRISPR专利的有力竞争者（延伸阅读：CRISPR先驱Nature、Molecular Cell连发重要成果 ）。

CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，其中II型CRISPR/Cas免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。CRISPR/Cas9成为了当前用于植物和动物中的一种强大的基因组工程工具。为了实现潜在的治疗应用，研究人员正在致力提高CRISPR/Cas9系统的DNA靶向效率和特异性。一些脱靶效应研究表明，CRISPR/Cas9系统DNA结合远没有DNA切割那样具有选择性，但目前对于控制DNA链切割的分子机制却知之甚少。 

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在CRISPR/Cas9系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA。Cas9核酸酶有两个功能结构域：RuvC和HNH。当两个结构域激活时，HNH核酸酶结构域剪切互补链， RuvC结构域剪切非互补链，在基因组上产生双链断裂（DSB）。

在这篇Nature文章中研究人员证实，Cas9核酸酶HNH结构域的构象状态直接控制了DNA切割活性。利用分子内荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer）实验，他们揭示出了HNH核酸酶结构域的一种激活构象。并证实一个完整的扩展α-螺旋(α-helix)充当了变构开关，将HNH的构象改变传达给RuvC结构域，激活它实现DNA切割。

作者们表示，她们的研究数据支持了一个模型：Cas9核酸内切酶利用了多个层次的调控来确保精确切割靶DNA。除了通过PAM结合及在sgRNA–DNA互补基础上定向解旋DNA识别潜在靶序列，识别靶DNA序列驱动了HNH核酸酶结构域发生了构象改变。这一结构转变触发了RuvC结构域催化活性，确保了协调切割两条DNA链。部分互补的脱靶DNA序列或许可以稳定结合Cas9，但却无法驱动HNH构象改变，从而避免的切割。

近期获得了金黄色葡萄球菌sgRNA/DNA结合Cas9晶体模型也显示一种无活性的HNH构象，表明HNH结构域构象控制是所有Cas9酶的一个普遍特征。并且，这一校对机制与I型CRISPR-Cas系统中RNA引导靶向复合物(Cascade)利用的R-环锁定机制惊人相似。

这些研究结果不仅提供了有关Cas9审查DNA机制的基本认识，对于Cas9作为一种基因工程技术的应用也具有重要的影响。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Conformational control of DNA target cleavage by CRISPR–Cas9

as9 is an RNA-guided DNA endonuclease that targets foreign DNA for destruction as part of a bacterial adaptive immune system mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)1, 2. Together with single-guide RNAs3, Cas9 also functions as a powerful genome engineering tool in plants and animals4, 5, 6, and efforts are underway to increase the efficiency and specificity of DNA targeting for potential therapeutic applications7, 8. Studies of off-target effects have shown that DNA binding is far more promiscuous than DNA cleavage9, 10, 11, yet the molecular cues that govern strand scission have not been elucidated. Here we show that the conformational state of the HNH nuclease domain directly controls DNA cleavage activity. Using intramolecular Förster resonance energy transfer experiments to detect relative orientations of the Cas9 catalytic domains when associated with on- and off-target DNA, we find that DNA cleavage efficiencies scale with the extent to which the HNH domain samples an activated conformation. We furthermore uncover a surprising mode of allosteric communication that ensures concerted firing of both Cas9 nuclease domains. Our results highlight a proofreading mechanism beyond initial protospacer adjacent motif (PAM) recognition12 and RNA–DNA base-pairing3 that serves as a final specificity checkpoint before DNA double-strand break formation.