Nature Methods：提高Cas9靶向范围和精度的突破性技术

　　

生物通报道   由麻省大学医学院分子、细胞和癌症生物学副教授Scot A Wolfe领导的一个研究小组报告称，他们开发了一项新技术通过融合可编程的DNA结合结构域(pDBD)和Cas9，可显著提高Cas9的精度及扩大它的靶向范围。这项研究成果发布在10月19日的《自然方法》（Nature Methods）杂志上。

由于其易于使用且高效，CRISPR-Cas9基因组工程系统正在彻底地改变生物科学。最常研究的Cas9核酸酶(SpCas9)来自化脓链球菌。SpCas9和它的相关导向RNA基于两个阶段的序列审查才会向一段DNA序列颁发切割许可证：首先，要求前间区序列邻近基序(PAM)元件兼容PAM互作结构域（PAM-interacting domain）的特异性；第二，要求导向RNA序列与靶位点互补。

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由于是通过导入一段互补的单导向RNA(sgRNA)，直接重编程Cas9来切割期望的靶位点，存在可兼容的PAM元件是限制Cas9靶向一个重要因素。野生型SpCas9的PAM互作结构域优先识别NGG元件。SpCas9-sgRNA系统的简单性使得能够很容易地对各种生物体和细胞系中的基因组进行编辑。

对于涉及编辑大量细胞的大多数基因治疗应用而言SpCas9的精度尚未达到最佳标准。许多的研究证实SpCas9可在非预期的位点切割基因。近期对开展的全基因组范围SpCas9精度分析表明，大多数基因组位点与导向RNA序列之间只有两个核苷酸的差异，还有一部分基因组位点具有三个核苷酸的错配。由于脱靶切割有潜力引起局部突变及基因组重排（例如，片段删除、倒位和易位），SpCas9治疗带来的附带损伤给治疗应用造成了负面的影响。

研究人员一直在尝试通过改变CRISPR-Cas9系统的结构和传送，例如改变导向序列的长度和组成，利用成对的Cas9核酸内切酶或FokI-dCas9核酸酶，可诱导地组装分开的Cas9片段，特异性增强的Cas9 PAM变体，及传送Cas9:sgRNA核糖核蛋白复合物等方法来减低脱靶切割率。然而，仍然无法确定这些改变是否可以在一大群的细胞中将对人类基因组的切割限制在单个位点。其中一些最有前景的方法（例如，成对核酸内切酶和二聚物FokI-dCas9）则限制了可靶向序列空间（延伸阅读：Nature技术突破：光控CRISPR-Cas9系统 ）。

在这篇Nature Methods文章中，麻省大学医学院的研究人员证实通过整合进诸如Cys2-His2锌指蛋白(ZFPs)或转录激活子样效应因子(TALEs)一类的pDBD，降低Cas9的固有DNA结合亲和力，他们能够生成一种Cas9-pDBD嵌合体，大大提高Cas9的精度及增大靶向范围。由于可以轻易地调控这一平台的特异性和亲和力，Cas9-pDBDs为我们提供了一个灵活的可定制系统，在几乎所有的基因组位点来实现极其精确的基因组编辑。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

DNA-binding-domain fusions enhance the targeting range and precision of Cas9

The CRISPR-Cas9 system is commonly used in biomedical research; however, the precision of Cas9 is suboptimal for applications that involve editing a large population of cells (for example, gene therapy). Variations on the standard Cas9 system have yielded improvements in the precision of targeted DNA cleavage, but they often restrict the range of targetable sequences. It remains unclear whether these variants can limit lesions to a single site in the human genome over a large cohort of treated cells. Here we show that by fusing a programmable DNA-binding domain (pDBD) to Cas9 and attenuating Cas9’s inherent DNA-binding affinity, we were able to produce a Cas9-pDBD chimera with dramatically improved precision and an increased targeting range. Because the specificity and affinity of this framework can be easily tuned, Cas9-pDBDs provide a flexible system that can be tailored to achieve extremely precise genome editing at nearly any genomic locus.