Science发布CRISPR基因编辑重大成果

　　

生物通报道  多亏了强大的基因编辑新技术，研究人员朝着构建出更安全的、可用于人类移植的猪器官这一目标迈进了一大步。在发表于10月11日《科学》（Science）杂志上的一篇论文中，他们描述在猪细胞中应用CRISPR编辑方法破坏了猪基因组62个位点的潜在有害DNA序列。这是有可能是迄今为止通过CRISPR实现精确、广泛遗传改变最极端的例子。它也为人们带了希望：这一技术最终可让猪器官适合于人体——这是论文的一些作者与一家私营公司正在进一步推进的目标（延伸阅读：Nature：遗传学大牛刷新CRISPR基因编辑记录 ）。

仅在美国就有大约12.25万人在等待器官移植来挽救生命，一些人认为稳定供应的猪器官可以弥补人类移植器官的不足，因为猪器官与人类器官的大小相似。然而直到现在，还没有人能够逃避猪细胞引发的强烈免疫反应。并且这些细胞还具有另一个更长期的潜在风险：它们的DNA中布满了许多拷贝的病毒残留物DNA序列，仍然可以生成感染病毒颗粒。研究证实，这种猪内源性逆转录病毒(PERV) 在培养皿中可从猪细胞移动至人类细胞，及感染移植到免疫系统薄弱小鼠体内的人类细胞。

哈佛大学遗传学家George Church和同事们完成的新CRISPR实验针对的就是这些PERV序列。Church认为，新研究工作将重振异种移植——即将动物器官用于人体这一想法。“基本上，整个这一领域已经停滞不前了15年。只有少数真正的信徒支持它。但我认为这将完全改变游戏。”

CRISPR是建立在细菌利用来破坏入侵病毒DNA古老防御机制上的一种方法。采用CRISPR，研究人员可通过一条短链导向RNA（gRNA）来靶向基因组中的特异位点，然后用一种酶来切割它以精确破坏基因或是插入新基因。

Church研究小组设计gRNA靶向了猪肾细胞DNA中62个PERV序列共有的一个基因。在一小部分细胞中，CRISPR系统除去了每一个靶基因——是迄今为止通过单次CRISPR达到的最大数量基因改变。在实验室培养皿中这些编辑细胞用PERV感染人类肾细胞的能力下降了1000倍。

CRISPR的原开发者之一、加州大学伯克利分校分子生物学Jennifer Doudna说，这些细胞在62个位点经历DNA切割后存活了下来是相当惊人的。相同的方法还可用作为研究工具来探究人类基因组中许多重复序列的功能，其中一些似乎在病毒感染过程中被激活。“这或许会鼓励一些实验室说，‘嘿，让我们做一次大胆的改变。”其他一些研究小组已成功地一次改造6个位点，5个不同的基因。

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Church警告说，编辑多个拷贝的单个重复基因序列不同于一次靶向许多独特基因——这是CRISPR变为复杂遗传疾病治疗方法的必要条件。他猜想实验能起作用是因为它利用了一种称作为基因转换（gene conversion）的罕见现象，CRISPR失活的DNA位点帮助阻止了细胞正确修复其他最近被切割的位点，导致了一种滚雪球效应使得所有的PERV拷贝最终永久失活。“我们不确定我们所做的是可泛化的。这并不意味着我们现在可以轻易地改变62个不同的基因。”

但这些结果与开发出可移植的猪器官有直接相关性。在上周美国国家科学院召开的一次基因组编辑会议上，Church报告称他的研究小组已成功构建出了PERV序列失活的猪胚胎——下一步是培育具有无逆转录病毒器官的克隆猪。这一壮举没有发布在这篇Science论文中。Church说，他的研究小组已成功失活了来自活体猪细胞中的PERVs，将这些细胞的细胞核转移到了猪胚胎中，但不会去证实PERVs在胚胎中失活。“我们还未准备去详述胚胎实验，除了说我们已经做了这些。”

如果可以消除PERV风险，跨物种移植研究人员将“减少一个要解决的问题，”斯克里普斯研究所研究所移植免疫学家和医生Daniel Salomon说。为了生成移植用猪，研究人员还必须要鉴别猪细胞中引起人类免疫系统排斥的许多其他的分子，采用一种不会导致猪死亡的方法来敲除各个基因。Church说，他的研究小组已经获得了这样的一份列表，正在致力用CRISPR和其他的方法来使得每个基因丧失功能。他们希望在2016年能够准备好一种免疫友好、无PERV胚胎移植到代孕猪妈妈体内。

一位经验丰富的异种移植研究人员说，Church的成功并不一定是好消息。匹兹堡大学医学中心移植免疫学家David Cooper也在探索猪器官移植，他指出美国食品和药物管理局（FDA）已表示，PERVs的存在并不一定会阻碍临床试验。事实上，他担心去除PERV元件的新能力可能会减慢该领域的进展，因为监管机构“现在或许会要求我们这样做，而没有任何证据表明这是必要的。”

FDA跨物种移植风险咨询小组负责人Salomon表示不赞同：“我并不会被PERV吓到。如果你可以将PERV传播可能性减小1000倍，你应该这样去做。”随着研究人员想到一些方法来编辑除去可引起器官排斥的其他特征，他也看到了该领域即将到来的重新复兴。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs)

The shortage of organs for transplantation is a major barrier to the treatment of organ failure. While porcine organs are considered promising, their use has been checked by concerns about transmission of porcine endogenous retroviruses (PERVs) to humans. Here, we describe the eradication of all PERVs in a porcine kidney epithelial cell line (PK15). We first determined the PK15 PERV copy number to be 62. Using CRISPR-Cas9, we disrupted all 62 copies of the PERV pol gene and demonstrated a >1000-fold reduction in PERV transmission to human cells using our engineered cells. Our study shows that CRISPR-Cas9 multiplexability can be as high as 62 and demonstrates the possibility that PERVs can be inactivated for clinical application to porcine-to-human xenotransplantation.