Cell子刊：lncRNA在棕色脂肪代谢中的新作用

   美国密歇根大学生命科学研究所Jian-die Lin研究员其主要研究方向包括营养和能量代谢中的转录共激活网络，生物昼夜代谢节律以及生理和疾病中的代谢重编程。近期其领导的研究团队发现了一个从前未知的lncRNA-Blnc1参与了棕色脂肪的分化过程，并与关键转录因子EBF2形成转录反馈回路。该成果2014年8月发表在国际顶级期刊Cell 子刊Molecular cell 上。 (影响因子15.28)。（芯片实验由Arraystar提供技术服务）

研究背景：
   代谢综合症是近年来国内外共同关注的热点问题，同时也是导致糖尿病，心血管疾病以及非酒精性脂肪肝的危险因素。白色脂肪用于储存能量，也是肥胖问题的根源。棕色脂肪富含线粒体并且特异性高表达线粒体膜蛋白UCP1,在冷刺激的条件下有效地产生热量同时减少脂肪生成和血脂浓度。米色脂肪细胞（布里特细胞）是一类新发现的脂肪，它们散在分布于白色脂肪组织中,受寒冷刺激或β3肾上腺素能受体激动剂激活后,表现出棕色脂肪细胞的特点:棕色脂肪标记物UCP1表达量上升，通过细胞内脂肪酸的非耦联氧化磷酸化分解产热。因此，提高棕色脂肪和米色脂肪的数目或增强他们的生物学功能是治疗肥胖以及相关代谢紊乱的潜在有效治疗方法。棕色脂肪和米色脂肪虽然分化的祖细胞不同，但在分化过程的分子机制非常相似，需要激活特定的转录因子调控网络。LncRNA可以在转录水平调控基因的表达，lncRNA如何和棕色脂肪分化过程中的转录因子调控网络互作有待揭示。

研究思路：
   在这项新研究中，研究人员进行了体内和体外的棕色脂肪细胞分化诱导实验。采用 Arraystar Mouse LncRNA V2.0芯片对诱导前后的细胞以及脂肪组织进行lncRNA和蛋白编码基因的表达谱检测，筛选得到21个在脂肪组织中高表达的lncRNA以及30个蛋白编码基因。对蛋白编码基因进行功能能分类分析，结果表明这些基因主要富集在线粒体结构和功能相关的条目内。挑选了3个位于基因间且在物种间保守度高的lncRNA进行了体外干扰（Knockdown）实验 ，最终将研究目标锁定在对棕色脂肪形成有明显作用的lncRNA AK038898上，并命名为Blnc1。Blnc1的表达随棕色脂肪细胞的分化过程逐步升高，并且在米色脂肪中表达量也显著上升。RACE实验证明Blnc1带有PolyA尾巴，长度为965bp, 没有蛋白编码能力是非编码RNA分子。细胞核质分离PCR实验证明Blnc1富集在细胞核中，提示该lncRNA在转录水平调控基因表达。

   随后，研究小组在体外培养的棕色脂肪前体细胞中过表达或敲除Blnc1，用表达谱芯片进行检测，发现Blnc1诱导了线粒体以及产热相关基因的表达。对细胞表型进行观测，其结果表明Blnc1促进了细胞内线粒体数目以及DNA 的含量显著升高，增强了细胞的氧化能力和解偶联呼吸功能。活体实验进一步证明Blnc1具有促进棕色脂肪形成的作用。

   米色脂肪细胞是在冷刺激或者肾上腺素刺激下形成的与棕色脂肪细胞类似的细胞。用肾上腺素激动剂CL-316,243诱导小鼠形成米色脂肪细胞，而后用PCR检测,发现在米色脂肪细胞诱导过程中棕色脂肪细胞标记UCP1以及Blnc1表达量上升。体外培养细胞的过表达和干扰Blnc1实验证明，Blnc1是米色脂肪细胞获得产热表型的关键分子。

   Blnc1诱导棕色脂肪和米色脂肪的形成只有在特定前体细胞系中才会出现，暗示这个lncRNA发挥生物学功能需要和其他的因子相互作用。研究者在成纤维细胞中将Blnc1和其他调控棕色脂肪基因表达的转录因子组合过表达，发现当转录因子EBF1和Blnc1共表达时有促进脂肪细胞形成的作用。进而研究Blnc1和EBF2的相互作用。Blnc1过表达情况下，EBF1和靶标基因启动子结合能力增强。RIP和RNA pull-down实验证明两者的物理结合。此外，EBF1的过表达能增加Blnc1的表达量，ChIP实验及报告基因实验证明EBF1能结合在Blnc1上游1.2kb左右的位点，激活Blnc1的表达。这些结果表明，Blnc1不仅能作为协同因子增强EBF1的活性，共同激活下游基因的表达，而且Blnc1自身也受到EBF1的调控，从而形成一个反馈回路。

技术路线： 

 
结果展示：

 
A. 韦恩图显示30个mRNA, 21个lncRNA在棕色脂肪组织里表达上升。
B. GO分析结果显示30个基因主要富集在线粒体相关条目内 。
C. 热图显示Blnc1在棕色脂肪和米色脂肪中表达上升。
D. 热图显示过表达Blnc1后线粒体及产热相关基因表达上调。

研究意义：
该研究揭示了lncRNA在棕色脂肪生成过程中的重要调控功能。在棕色脂肪和米色脂肪生成过程中，长链非编码RNA-Blnc1表达水平显著上升。体外实验表明，Blnc1能和棕色脂肪分化关键转录因子EBF2形成复合物，增强其对下游靶标基因的调控作用。同时，长链非编码RNA-Blnc1自身也受EBF2的调控。该研究确定了一个参与棕色脂肪分化的关键lncRNA,为代谢综合症的提供了新的治疗思路，具有重要的科学意义。

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原文出处：
A Long Noncoding RNA Transcriptional Regulatory Circuit Drives Thermogenic Adipocyte Differentiation. Mol Cell. 2014, Aug 7;55(3):372-82.
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