2014创新产品：可替代PCR的核酸检测技术

过去6年，生物通一直在追踪生命科学领域最前沿的创新产品，将其介绍给大家。2014年，生物通继续搜罗新上市的产品，为大家奉上一场技术盛宴。经过一个半月的网页和微信投票以及专家评鉴，2014生命科学十大创新产品终于出炉。

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术因有望替代经典的PCR技术，而让人印象深刻。与PCR的频繁升降温不同，这是一种等温扩增，因此能大大加快反应速度。与此相对应的是，它对硬件设备的要求更低，特别适合应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全等领域。基于这些优势，英国TwistDx公司开发的TwistAmp®核酸扩增产品被评为2014年度的创新产品。

RPA反应的最适温度在37°C - 42°C之间，无需变性，在常温下即可进行。它不需要温控设备，可以真正实现便携式的快速核酸检测。RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，且不需要复杂的样品处理。值得一提的是，RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。目前，TwistAmp试剂盒的扩增子长度在500 bp以内，不过，经过优化也能生成更长的扩增子。

基本原理

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。
 
重组酶与引物结合形成的蛋白质-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，两个相对的引物启动一个合成事件。整个过程非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

这个只是基础，还可以扩展。在这个体系中加入不同的酶和探针，就可以实现多样化的RPA应用。举例来说，在基础体系里添加逆转录酶（TwistAmp® Basic RT），可以对RNA模板进行一步法扩增。将RPA基础体系、专利的exo探针技术和核酸外切酶III结合起来（TwistAmp® exo），能实现数据的实时读取，就像荧光定量PCR一样。【延伸阅读：核酸检测的一场革命，可替代PCR的犀利技术】

广泛应用

不难想象，这些优势使得RPA成为低成本的分子诊断检测的出色候选。多个研究团队利用此项技术，已经开发出埃博拉等致命病毒和病原体的检测工具。同时，RPA技术也在HIV检测和癌症研究中大显身手。

需要提醒的是，RPA的引物设计原理虽然与PCR相似，但两者的引物并非能够通用。RPA引物的长度一般为30至35个核苷酸。若使用PCR的引物，则意味着重组率较低。而长的引物也不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。如何才能设计出好的RPA引物呢，请看RPA全攻略之引物设计。另外，生物通小编也整理了一些FAQ，相信能帮助你更好地了解这一技术。