专家指南：CRISPR实验中如何选择sgRNA[心得点评]

CRISPR技术为基因组编辑带来了一种快速简单的方法，因此备受人们青睐。然而，在具体的实验过程中，我们也面临着一些问题。无论是针对目的基因来设计少量sgRNA，还是为覆盖基因组来设计sgRNA库，我们都面临如何选择的难题。为此，Addgene再次请来了Broad研究院的CRISPR专家John Doench，谈谈如何优化sgRNA的活性。上一次，Doench介绍了CRISPR实验中如何设计gRNA。

预测sgRNA的效果

Doench博士最近研究了能增强sgRNA的on-target活性的序列特征。他们发现，一些序列确实比另一些更好，而PAM的变化会导致活性的差异。具体而言，CGGT往往比典型的NGG序列更好。通过研究1841个sgRNA中最有活性的sgRNA，他们得出了评分规则，并建立了一个网站，运用这些规则来设计sgRNA。这个网站的地址是：http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design。

一旦确定了可能最高效的sgRNA，那么下一步需要进行一些过滤，以便进一步筛选。例如，利用目的基因的基本特征来排除一些sgRNA，比如靶定蛋白质C端的那些，因为大部分的蛋白质都已经翻译，移码突变不大可能有害。尽管每个蛋白质都不同，但靶位点在前半部分似乎是合理的。不过Doench也提到，对于有些基因，即使有些靶位点非常靠近C端，也能破坏表达。当然，这不能一概而论。

避免脱靶效应

sgRNA的脱靶效应也是一个重要的考虑因素。关于脱靶效应的程度，几篇论文得出了不同的结论，但至少有一点可以肯定，这些差异的一个原因是Cas9的表达水平和研究中所用的sgRNA。此外，预测基因组中脱靶位点的能力尚处于起步阶段。目前还没有足够的数据来预测哪些位点可能或不可能表现出明显的修饰水平。同时，研究也表明，RNA或DNA中的凸起也可能带来脱靶效应，但现有的算法往往忽略这些位点。

最近一些CRISPR修饰细胞的全基因组测序结果表明了脱靶效应的后果，至少在所使用的实验条件下，产生了检测不到的突变。此外，针对同一基因的不同序列表现出高的一致性，表明脱靶效应并没有压倒真正的信号。Doench博士再次强调了实验策略：对于任何感兴趣的基因，需要不同序列的多个sgRNA产生相同表型，才能下结论说这个表型是on-target的结果。

怎么会出错呢？

即使是经过优化的on-target设计，尽力避免off-target效应，显然并非所有基因在细胞背景中都能轻松靶定。一个主要原因是目的位点的染色质状态。对于那些受限制染色质中的基因，Cas9显然不太容易发现它们。在此，单细胞克隆可能是必要的，而RNAi等互补技术也是一个更好的选择。

总的来说，选择sgRNA时需要最大限度提高on-target活性，同时降低off-target活性。这听上去很简单，但往往也需要艰难的抉择。例如，到底是选一个活性不太高，但靶定基因组中唯一位点的sgRNA，还是选一个更高效，但靶定两个位点的sgRNA呢？Doench认为，在创建长期研究所用的稳定细胞模型时，前者可能是更好的选择。而在利用sgRNA库进行遗传筛查时，由后者组成的库可能更加高效，但在解释结果时要小心。

Doench认为，这是功能基因组学的最好时代，有越来越多的工具来探索基因功能。然而，再好的工具也不如使用它们的人，CRISPR技术的正确使用取决于精心设计、实施和分析。

如果你还想了解设计sgRNA的更多建议，可以读一读John Doench最近发表在《Nature Biotechnology》上的文章，题目为“Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9–mediated gene inactivation”。（生物通 余亮）

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