蛋白质印迹手册19：快速的免疫检测方法[创新技巧]

快速免疫检测利用了抗体不能与未润湿的Immobilon®-P转印膜的疏水表面结合，但能与膜上固定的蛋白质结合的事实。快速免疫检测均可与显色底物和化学发光底物兼容。

提示：使用快速免疫检测方法可快速观察较高丰度的蛋白质。若需要更高的灵敏度，请使用标准的免疫检测方法。

快速免疫检测的优点是不需要封闭，节省时间，避免相关的风险（Mansfield，1994）。同时，因为过量的抗体不会与干燥的膜结合，所需的清洗次数也减少。因此，分析的总时间在2小时以下，而标准方法需要4小时以上。

切记：在开始快速免疫检测之前，印迹必须彻底干燥。

必需的溶液
• 一抗（目的蛋白特异的）。
• 二抗（一抗特异的），标记碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
• 适合酶的底物。
• 磷酸盐缓冲液（PBST）：10 mM 磷酸钠、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。
• 抗体稀释液：1%（w/v）BSA（牛血清白蛋白），0.05% 吐温20去污剂。
• 封闭液：1%（w/v）BSA（牛血清白蛋白），0.05% 吐温20。
• 甲醇，100%。
• Milli-Q® 水。

必需的设备
• 浅托盘，大小能容纳印迹膜。
• 保鲜膜（如Saran™）、冷冻袋或纸片。
• 放射自显影胶片和暗盒。
• 暗室和放射自显影胶片冲洗设备。

准备
1. 利用操作1.7 膜干燥方法，第44页，让印迹彻底变干。切勿让甲醇再次润湿印迹。
2. 用稀释液将一抗稀释到所需的工作浓度。
3. 用稀释液将二抗稀释到所需的工作浓度。
注意：应准备足够的溶液，让每cm2 膜有0.1 mL抗体溶液（一抗和二抗）。

抗体孵育
1. 将印迹放入一抗溶液中，摇动孵育1小时。溶液应在膜表面自由移动。
2. 将印迹放入PBS中，清洗5分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
3. 将印迹放入二抗溶液中，摇动孵育30分钟。
5. 将印迹放入PBS中，清洗5分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
6. 继续进行显色、化学发光或荧光检测，如操作3.1 标准免疫检测方法（第48页）所述。

利用SNAP i.d.® 2.0系统进行快速的免疫检测

SNAP i.d.® 2.0蛋白质检测系统是第二代的SNAP i.d.® 方法，可检测Western印迹上具有免疫反应的蛋白质。有了这种独特的真空驱动系统，试剂被“拉”过膜，增加了试剂与膜内部的接触，而不必依靠缓慢的扩散和摇动。这种改良的三维的试剂分布可减少免疫检测所需的时间长度。在传统的Western印迹中，封闭、抗体孵育和清洗步骤需要4-24小时，而SNAP i.d.® 2.0只需要30分钟，且不会损失信号强度或降低印迹质量。蛋白质转移到膜上之后的所有免疫检测步骤（即封闭、清洗以及一抗和二抗孵育）可在SNAP i.d.® 2.0系统中开展。

必需的溶液
• 封闭液，如脱脂/低脂奶粉（0.5%或以下）、酪蛋白、牛血清白蛋白（BSA）或其他市售的封闭剂，如Bløk®-CH试剂。
• 抗体（单克隆和/或多克隆）。
• 检测试剂。
• 清洗液：Tris或磷酸盐缓冲液，pH 7.4，添加吐温20表面活性剂（TBST或PBST）。

必需的设备
• 真空源：泵或其他均一的真空源，可提供稳定持续的最小压力达到410毫巴（12英寸汞柱）的和34L/min。
• 注意：默克密理博WP61系列化工型泵可以使用，但可能需要较长的处理时间。
• 一升或更大的真空瓶，带瓶塞（用于废液收集）。建议在真空瓶和真空源之间使用Millex®-FA50过滤器（或类似产品），以避免真空源被污染。
• 真空管，连接真空瓶和真空源。
• 镊子。
• 带有转移蛋白的印迹。

准备
1. 将SNAP i.d.® 2.0底座放在水平台面上。
2. 将真空管连接到系统背面，将管子一端的接头推入系统底座背面的快速断开装置，直到听到咔嗒一声。
3. 将管子的另一端与真空源连接。使用一升的真空瓶作为真空肼，并使用Millex®-FA50过滤器（货号SLFA05010），以避免真空源被污染。
注意：任何可提供410毫巴（12英寸汞柱）和34L/min的真空源已足够。如果真空源在高于410毫巴下操作，SNAP i.d.® 2.0系统将自动调节真空压力。

印迹组装 & 常规操作
1. 按住印迹支架的支持层（蓝色边），用湿托盘中提供的蒸馏水将膜层（白色）润湿。将润湿的印迹支架放在滚动垫上。
2. 如有必要，用甲醇和水预润湿印迹，然后将其放在印迹支架的中央，蛋白质一面朝下。
3. 用印迹滚筒在印迹上轻柔滚动以去除气泡，然后盖上印迹支架，再滚动一次。
4. 打开印迹支架框，反转印迹支架，让蛋白质一面朝上，然后放回印迹支架框中。印迹支架的缺角可确保它正确放置在框内。
5. 盖上并锁住印迹支架框。加入30 mL封闭液。按下印迹支架框，打开系统旋钮，施加真空。当印迹支架框彻底清空时，关闭真空。
6. 在印迹支架的表面加入5 mL（对于Mini印迹）或10 mL（对于Midi印迹）一抗。
7. 室温下孵育10分钟。溶液将吸收到印迹支架内，而表面可能看上去是干的。
8. 按下框架，施加真空。等待5-8秒后，框架彻底清空。
9. 让真空持续，加入30 mL清洗液。重复清洗步骤3次（总共4次清洗）。当框架彻底清空时，关闭真空。
10. 在印迹支架的表面均匀加入5 mL（对于Mini印迹）或10 mL（对于Midi印迹）二抗。室温下孵育10分钟，此时真空关闭。同样，溶液将吸收到印迹支架内，而表面可能看上去是干的。
11. 按下框架，施加真空。等待5-8秒后，框架彻底清空。让真空持续，加入30 mL清洗液。重复清洗步骤3次（总共4次清洗）。
12. 关闭真空，从框架中取出印迹支架。从中取出印迹，与适当的检测试剂一起孵育。

一抗时间延长
孵育：1小时至过夜
1. 开展一般操作的第1-5步。
2. 加入5 mL（对于Mini印迹）或10 mL（对于Midi印迹）1X一抗（传统免疫检测中通常使用的浓度）。
3. 用盖子盖住印迹支架框。如有必要，从底座中取出，摇动孵育。若需要过夜孵育，建议冷藏。尽管印迹支架的表面可能看起来有些干燥，但印迹不会变干，因为框架内包含溶液。
注意：如果不止一个印迹需要延长时间，印迹支架框可堆叠，以减少存储空间。
4. 可选：如果要回收一抗，在第4步操作之前将抗体回收托盘放入底座。
5. 延长孵育时间后，将框架放回底座，去除液体，并按照一般操作的第8-12步操作。
注意：对于SNAP i.d.® 2.0系统来说，延长二抗的孵育时间是不必要的。建议使用5X浓度的二抗，孵育10分钟。

抗体回收
1. 开展一般操作的第1-5步，但将真空时间增加至2分钟，以确保所有封闭液从框架的凹槽和通道中去除。
2. 从底座中取出印迹支架框，用纸巾擦去框架底部的所有残留液体。
3. 将抗体收集托盘放入底座中，确保托盘的定位孔与底座的定位针对齐。
4. 将印迹支架框放回底座中。
5. 加入一抗，并按照一般操作中的第6-7步孵育。
6. 孵育10分钟后，打开真空，等待1分钟，以确保所有抗体已被收集。
注意：在同时处理两个框架时，先在一侧施加真空，再在另一侧。这确保每个框架都有完全的真空力，并改善回收量。
7. 关闭真空，取出框架。取出抗体回收托盘。
8. 将抗体转移至适当的容器内，以便保存或分析。
9. 将印迹支架框放回去，继续一般操作的第9步。

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