中科院Nature子刊发表CRISPR新文章

9月18日，自中科院遗传与发育生物学研究所研究人员在《Nature Protocols》杂志上发表了一篇题为“Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system”的文章，详细描述了利用CRISPR/Cas系统分步实现水稻和小麦基因组编辑的一种实验方案。

　　

生物通报道  9月18日，来自中科院遗传与发育生物学研究所的研究人员在《Nature Protocols》杂志上发表了一篇题为“Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system”的文章，详细描述了利用CRISPR/Cas系统分步实现水稻和小麦基因组编辑的一种实验方案。

中科院遗传与发育生物学研究所的高彩霞（Caixia Gao）研究员是这篇论文的通讯作者。其主要研究领域包括农作物基因组定向编辑技术体系的研究与应用、农作物遗传转化技术体系的建立与应用，以及小麦重要功能基因的分子生物学研究。

靶向性基因组编辑技术成为了近年来了解基因功能以及在植物中开发有价值的新性状的强大工具。锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas系统是构成基因组编辑的三大核心技术。

ZFNs曾被认为是最有潜力的基因改造技术。但锌指基序（motif）同其靶序列的对应性并不特异，对于每一个特定的靶点，往往需要构建庞大的锌指表达文库，通过实验筛选出高效且特异结合靶序列的锌指蛋白；而且在基因组上找到合适的ZFN靶点也比较困难。因而这种技术工作量大、花费昂贵且具有毒性。TALEN技术既能够像ZFN一样精确地修饰复杂的基因组，又具有比ZFN更容易设计的优点，即具备了ZFNs技术特异结合目标DNA特异性的优点，同时消除了它的一些缺点，比ZFNs更容易设计、特异性更高且毒性更低。

CRISPR／Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中，是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。针对II型CRISPR／Cas系统进行改造，使其成为了继ZFNs和TALENs以来的高效定点修饰新技术。相比于ZFNs和TALENs，CRISPR／Cas系统更简单，并且更容易操作。在这一系统中，只需改变单导向RNA (single-guide RNA,sgRNA)中20个核苷酸（nt）的目标序列就可以靶向不同的基因。简单的克隆策略和对潜在目标靶点较少的限制使得CRISPR/Cas非常具有吸引力（延伸阅读：The Scientist:聚焦CRISPR研究先锋张锋 ）。

在这篇新文章中，作者们描述了由选择靶位点，到设计、构建、验证及利用sgRNAs在水稻和小麦中实现CRISPR/Cas介导序列特异性突变发生及基因打靶的一种分步实验方案，其中尤为详细地介绍了sgRNAs和Cas9构建和表达的步骤和时间表。第一阶段sgRNAs的构建需用4天时间分11步完成，将靶点特异性的sgRNA寡核苷酸（oligos）克隆到sgRNA支架载体中在原生质体中实现短暂表达。第二阶段是进行验证，大约需要6天时间。第一天，首先分离出原生质体。随后的两天，根据第13-25步骤用PEG介导原生质体转化。再用三天时间，按照第26-29步骤检测原生质体中的突变。最后一个阶段是获取突变。在随后的13-17周时间内，按第30-37步利用基因枪实现对水稻的稳定转化。最后3天，第38-41步则是对转基因水稻中的插入和缺失（indels）进行检测和测序。

这篇新文章为我们提供了一种可在1-2周内在原生质体中实现快速基因打靶，并在13-17周内生成突变植物的简单直接的实验方案。

（生物通：何嫱）

作者简介：

高彩霞

女，研究员，博士生导师

1991年获甘肃农业大学学士。1994年获甘肃农业大学硕士。1997年获中国农业大学博士。1997-1998年丹麦DLF-Trifolium公司科研部博士后。1998-2009年丹麦DLF-Trifolium公司科研部Research Scientist，课题组长。2009年9月回国，在遗传发育所植物细胞与染色体工程国家重点实验室任研究员，课题组长，2010年入选中国科学院“杰出技术人才”。

主要研究领域：农作物基因组定向编辑技术体系的研究与应用、农作物遗传转化技术体系的建立与应用，以及小麦重要功能基因的分子生物学研究。

生物通推荐原文摘要：

Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system

Targeted genome editing nucleases, such as zinc-finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs), are powerful tools for understanding gene function and for developing valuable new traits in plants. The clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR)/Cas system has recently emerged as an alternative nuclease-based method for efficient and versatile genome engineering. In this system, only the 20-nt targeting sequence within the single-guide RNA (sgRNA) needs to be changed to target different genes……