新手指南：如何搞定干细胞的低温保存

生物通报道：在过去十年里，多能干细胞成为了多个领域的实用工具，帮助人们探索发育生物学、研究疾病病理和开发细胞疗法。

不论你用干细胞做什么研究，都离不开低温保存。冷冻可以保存珍贵的干细胞资源，不过冷冻干细胞可不像冷冻已分化细胞那么简单。我们不能简单沿用普通细胞的冷冻试剂和方案。

科学家们一开始对人胚胎干细胞进行操作时发现，一次冻融循环之后只有5%的细胞还具有多能性。这是因为压力条件会促使细胞发生分化，Fraunhofer细胞疗法和免疫研究所的Alexandra Stolzing说，“如果保存的干细胞发生了随机分化，就没有价值了。”

另外，冷冻还会激活一个程序性死亡通路，而且在绝大多数情况下添加凋亡抑制剂收效甚微。科学家们一直在试图理解，低温究竟对多能干细胞产生了什么影响，希望在此基础上开发更好的冷冻方法，让更多细胞存活下来。

应该用什么来冷冻干细胞？

这个问题的答案取决于你的细胞系，不过大多数成功的冷冻方案也有一些共同点。人们一般先用蛋白酶来解离细胞，然后进行离心，最后用含有冷冻保护剂的培养基重悬。经典的冷冻保存培养基，由90%的胎牛血清（FBS）和10%的DMSO组成，DMSO可帮助细胞抵御冷冻带来的有害影响。但是如果你的细胞要用于人体，上述试剂就不合适了，它们可能有毒会带来副作用。此外，使用90 FBS/10 DMSO混合物时，细胞复苏之后的活性往往较差。近来，研究者们纷纷开始使用无动物源成份的试剂，以及更低浓度的DMSO。Caspase抑制剂常被用来避免细胞凋亡。

今年早些时候，RIKEN发育生物学中心的Teruo Akuta等人比较了不同的低温保存方案和试剂，为自己的胚胎干细胞和诱导多能干细胞确定理想的培养基。他们发现，在冷冻前用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA处理，可以提高干细胞的复苏率。Akuta指出，干细胞喜欢抱团生长，但冷冻保护剂难以浸透较大的细胞团块，用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA可以将细胞分成大小均一的小簇。Akuta团队还改良了商业化的低温保护剂CP-1，CP-1含有羟乙基淀粉（植物源的冷冻保护剂）和DMSO。他们通过添加人血清白蛋白和乙二醇，进一步提高了培养基的效力。研究显示，添加乙二醇时的复苏效率最高，有活力的细胞占到44%。不过，这样的组合并不一定适用于任何人。（延伸阅读：Science：iPS临床应用这次真的来了？）

“并没有所谓的最佳冷冻保护剂，”牛津大学的Zhanfeng Cui说。他建议新手们尝试不同试剂，查阅用到了相同细胞系的文献。许多人直接把细胞放在10% 的DMSO里冷冻，然后等着出现好结果。“花几个小时查文献，就能为你节省大量的时间，”他指出。“培养干细胞是个高成本又费时的过程，我们要尽可能的保护资源。”

冷冻的速度重要么？

绝大多数低温保存方案是，先将样本放在–80 °C冰箱过夜，第二天再转移到液氮进行长期储存。有研究发现，使用程序性的冷冻方法能获得更好的结果。这种方法通过特殊设备，控制样本温度以稳定速度降低（每分钟几度）。不过就算你没有这样的设备也不必灰心，因为也有文章认为最终的细胞产量并没有太大差异。

 

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现在还出现了一种新兴的冷冻方法，即玻璃化（vitrification）。玻璃化是指通过超快速冷却，形成糖浆一般的液态而不是结晶的固态。这种方法能避免形成冰晶，但需要高浓度的冷冻保护剂和特殊的设备。

“还是那句话，要反复尝试才能找到最适合自己细胞的方案，” Stolzing说。如果你只有–80度低温冰箱，那么就试着优化培养基提高产量。如果有条件，控制冷却速度和玻璃化冷冻都很值得一试。

应该如何复苏干细胞？

在理论上，细胞在–196 °C的液氮中可以稳定存在很多年。激活细胞死亡和分化通路的是冷冻和复苏过程。因此，复苏干细胞的时机完全取决于你自身的需要。冷冻过程需要慢而稳，而细胞复苏要很快。

“对于细胞复苏而言，速度是很有必要的，”Stolzing说。“现在大家都在追求快速复苏。”

干细胞的试管可以放在37°C水浴中解冻，然后用生长培养基重悬。如果想除去DMSO，还可以洗几个循环。细胞复苏之后，最好用几天时间来培养，筛查它们的功能是否正常。

我能得到怎样的产量？

如果幸运的话（你的干细胞系特别有活力），第一次进行冻融可能会得到40%、50%甚至更高的产量。但是如果你的产量只有10%左右甚至更低，也完全用不着惊讶。方法的优化往往需要多次尝试，Cui说。

另外计算产量不要操之过急，佛罗里达州立大学的Yan Li提醒到。“最初的细胞活力可能有误导性，”她说。“细胞解冻之后有时要过一会儿才开始死亡，你可能会最终失去植板的细胞。”研究显示，细胞死亡在植板后大约24小时达到高峰，因此最好等一等再来计算产量。

复苏后的细胞还是干细胞么？

“对于干细胞而言，复苏得到活细胞并不是我们的最终目标，”Cui说。“关键问题是，这些细胞是否丧失了多能性。”除了在显微镜下分析形态，观察细胞植板后的生长模式，他还建议在冻融循环前后用相应标记（例如Oct-4）进行染色。这样我们就能够了解干细胞的分化情况。在细胞复苏后，也可以通过商业化芯片来检测拷贝数变异、表观遗传学改变和染色体畸变。

复苏的产量低没什么大问题，我们只需要培养更多细胞就行。但是我们不能假定存活下来的细胞与原始细胞相同，特别是在产量很低的情况下。“存活下来的细胞可能经过了某种选择，” Cui说。“我们正在尝试理解这个问题。”

 

生物通编辑：叶予

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