蛋白质印迹手册23：故障排查（下）[创新技巧]

蛋白质印迹出了问题？没关系，下面的troubleshooting指南一定能帮助你找出可能的原因，并为你提供补救办法。

3. 蛋白质观察

症状	可能的原因	补救办法
透照法检测不佳	膜不合适	透照法最适合Immobilon®-P转印膜。不建议使用硝酸纤维素或Immobilon®-PSQ转印膜。
	在用甲醇润湿前，膜未彻底干燥	确保膜在转印后彻底干燥，才浸入20%的甲醇溶液中。一定要使用20%的甲醇溶液。
	印迹只用水饱和	用20%甲醇饱和印迹。
	印迹不够饱和	将甲醇浓度提高到最多40%。
染色弱或不均匀	膜在染色前未用甲醇润湿	膜必须用甲醇预润湿；整张膜应均匀地从不透明变为半透明。
不均匀/有污点的结果	使用足够量的孵育溶液，并确保孵育过程中膜被这些溶液完全覆盖	所使用的容器应足够大，让溶液在印迹上自由移动。每次切勿在同一个容器中孵育超过一张印迹。此外，印迹的蛋白质一侧应朝上，这样就不会与容器的底面相互作用。
	气泡	印迹的表面不应有任何气泡。沿容器边缘轻拉膜，以赶走气泡。
	试剂质量不佳	所有的缓冲液和试剂应当是新鲜的，不含颗粒和污染物。使用Millex® 针头式过滤器或Stericup®、Steritop® 或 Steriflip®过滤装置来过滤缓冲液，抗体储液可能需要离心。
背景染色高	蛋白质与膜的非特异性结合	确保使用干净的电转移设备和组件，以及高质量的试剂和Milli-Q® 水。

4. 免疫检测

症状	可能的原因	补救办法
信号弱	封闭试剂不适当	封闭剂可能对目的蛋白有亲和力，从而掩盖了蛋白，影响检测。尝试不同的封闭剂和/或降低封闭剂的量或暴露时间。
	抗体孵育时间不够	增加孵育时间。
	抗体浓度太低，或抗体无活性	抗体溶液的反复冻融或细菌污染可能改变抗体的滴度或活性。提高抗体浓度或新鲜制备。
	检测试剂过期	使用新鲜的底物并适当保存。过期的底物会降低灵敏度。
	蛋白质转印的问题	优化蛋白质转印（见上文）。
	显色检测中的印迹干燥	如果使用显色检测系统，对比度不佳，那么印迹可能已干燥。尝试用水重新润湿印迹，以便最大限度提高对比度。
	自来水让显色检测试剂失活	在准备试剂时使用Milli-Q® 水。
	叠氮化物抑制HRP	请勿在封闭液中使用叠氮化物。
	抗原浓度太低	转印之间在凝胶中上样更多的抗原。
无信号	抗体浓度太低	增加一抗和二抗的浓度。
	HRP抑制	HRP标记的抗体不应使用在包含叠氮化钠的溶液中。
	一抗是针对天然蛋白的	在非变性凝胶中分离蛋白质，或使用针对变性抗原的抗体。
不均匀的印迹	印迹上出现指纹、折痕或镊子痕迹	不要触摸或折叠膜；使用手套和钝端镊子。
有污点的背景	封闭试剂中有结块	通过0.2 μm或0.45 μm的Millex® 针头式过滤器装置来过滤封闭液。
	HRP标记的二抗中有聚集物	通过0.2 μm或0.45 μm的Millex® 针头式过滤器装置来过滤二抗溶液。
背景高	清洗不够	增加清洗量和次数。利用Millex® 针头式过滤器或Steriflip®过滤装置来预过滤所有溶液，包括转印缓冲液。
	二抗（酶结合）抗体浓度过高	增加抗体稀释度。
	蛋白质之间相互作用	在清洗和检测溶液中使用吐温20（0.05%），以减少蛋白质之间相互作用，并提高信噪比。
	Immobilon®-PSQ转印膜上的免疫检测	增加封闭液的浓度或量，以补偿更大的膜表面积。在清洗缓冲液中加入最多0.5 M NaCl和0.2% SDS，并将清洗时间延长至2小时，可减少顽固的背景。
	试剂质量不佳	使用高质量的试剂和Milli-Q® 水。
	封闭液和抗体之间的交叉反应性	使用不同的封闭液或在清洗液中加入吐温20去污剂。
	胶片曝光过度	缩短曝光时间。
	孵育过程中膜变干	在孵育过程中使用足量溶液，以覆盖膜。
	抗体质量不佳	使用高亲和力的纯化抗体。
	检测试剂过量	在曝光前彻底排干印迹。
顽固背景	非特异性的结合	使用高盐清洗。（操作3.4，第54页）
症状	可能的原因	补救办法
背景高（快速免疫检测）	在快速免疫检测过程中膜湿透	减少抗体稀释液中的吐温20（< 0.04%）去污剂。 在孵育过程中轻柔摇动。 在电转移之后用Milli-Q® 水冲洗印迹，以去除凝胶上残留的SDS。在开始任何检测操作之前，确保印迹彻底干燥。
	免疫检测之前膜用甲醇润湿	切勿预润湿膜。
	免疫检测之前膜未彻底干燥	确保膜已彻底干燥，再开始检测。
非特异结合	一抗浓度过高	增加一抗稀释度。
	二抗浓度过高	增加二抗稀释度。
	抗原浓度过高	降低凝胶上蛋白的上样量。
胶片上图像倒转（黑色背景上出现白色条带	太多HRP结合的二抗	降低HRP结合的二抗浓度。
小蛋白的检测不佳	小蛋白被大的封闭分子（如BSA）所遮蔽	考虑使用酪蛋白或低分子量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。 表面活性剂，如吐温和Triton® X-100应减少。 避免用抗体和清洗液孵育过长时间。

5. 荧光检测

症状	可能的原因	补救办法
整体背景高	印迹膜的背景荧光高	使用Immobilon®-FL转印膜。
	封闭试剂未针对荧光检测而优化	使用Bløk®-FL Noise-canceling试剂，为荧光Western印迹而优化。
多重分析的问题	实验设计	两个抗体必须来自不同的宿主物种，这样它们才能被不同特异性的二抗所区分。在使用两个一抗之前，需要分别在单独的印迹上检测条带模式，以确定条带出现的位置。在双色检测中应使用交叉吸附过的二抗。
背景有污点	处理印迹时有灰尘/粉末颗粒	戴上无粉尘手套处理印迹，并清洁扫描仪的表面。
信号低	湿的印迹	干燥印迹可提高信号强度。印迹可重新润湿后再扫描。在扫描时切勿用保鲜膜或Saran™膜包住印迹。
	印迹光漂白	尽管荧光染料通常能提供持久的稳定信号，但一些荧光染料会很容易发生光漂白。为了防止光漂白，在二抗孵育和清洗时应保持让膜避光，直至准备进行扫描。将显像好的印迹保存在暗处，以便后续成像。
	错误的激发波长	在印迹成像或使用发射滤光片时遵照染料制造商的使用说明。

上一篇          下一篇

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》