蛋白质印迹手册22：故障排查（上）[创新技巧]

蛋白质印迹出了问题？没关系，下面的troubleshooting指南一定能帮助你找出可能的原因，并为你提供补救办法。

1. 斑点（过滤）印迹

症状	可能的原因	补救办法
样品滤过膜的流速慢或无法滤过	真空不够	确保印迹装置已正确关闭，且密封完好。 确保真空源（如泵）运行正常。 用高品质的实验室胶带密封所有开孔。提高真空水平。
	膜的孔被堵塞	离心或过滤样品，以去除颗粒。 用缓冲液稀释粘稠的样品。
在印迹上观察到很少蛋白或无蛋白	上样到膜上的蛋白质不够	最大限度减少样品稀释，过滤更多的样品。
	去污剂（如SDS）可能抑制低分子量蛋白质与膜的结合	如有可能，去除去污剂。
	染色不够灵敏	使用更加灵敏的染料。
染色的印迹不均一	膜的结构被滤纸压缩	在印迹装置中放置第二张膜，以保护接收样品的膜。
	气泡截留在膜的内部	将膜放在甲醇表面，预润湿膜。浸没膜可能会截留空气。
	膜未在甲醇中预润湿	膜必须用甲醇预润湿；整张膜应均匀地从不透明变为半透明。
	样品中有气泡	小心移液孔中的样品，以避免气泡形成。
	上样量不够	样品必须覆盖整个暴露的膜区域。
膜上面的蛋白弥散	孔中的样品渗漏	在过滤前确保印迹装置正确组装、关闭和密封。
膜背面的蛋白弥散	超过了膜的容量	减少孔中的蛋白上样量。

2. 半干转印或槽转印

症状	可能的原因	补救办法
条带弥散/扭曲	膜未在甲醇中均匀润湿	整张膜必须用甲醇预润湿；整张膜应均匀地从不透明变为半透明。
	膜下以及堆积层的其他各层之间存在气泡	在组装堆积层时，利用移液管或搅拌棒，轻柔滚动以去除任何截留的气泡。
	凝胶和膜之间的接触不均匀	确保整张凝胶和膜的表面有良好接触。
	在转印过程中产生太多热	运行的温度不应超过20°C。对于槽转印，预冷缓冲液，或在冷室中开展转印。对于半干转印，要么缩短运行时间，增加滤纸数量，要么降低电流。
	在半干转印过程中滤纸变干	在转印之前确保滤纸彻底湿透，或使用更多滤纸。确保堆积层在15分钟内组装好。
	蛋白质转印太快；蛋白质累积在膜表面	降低电场强度。
信号弱	蛋白质穿过膜	将电压降低最多50%，增加蛋白质必须与膜接触的时间。
		高负电荷的蛋白质（由于天冬氨酸和谷氨酸含量高）往往在电场中非常快速地移动。降低电压，以减慢这些蛋白质的迁移。
		凝胶中SDS的存在可能抑制蛋白质的结合。在转印缓冲液中平衡凝胶至少15分钟。
		转印缓冲液中甲醇浓度太低，不利于SDS的去除。将甲醇增加至15-20%，特别是对于较小分子量的蛋白质。
		膜必须用甲醇预润湿；整张膜应均匀地从不透明变为半透明。
	蛋白质保留在凝胶中	如果转印缓冲液中的甲醇浓度过高，它会去除蛋白质中的SDS，导致蛋白沉淀在凝胶中。这会降低高分子量蛋白质的转移。如果蛋白沉淀是个问题，那么可在转印缓冲液中添加SDS（0.01%-0.05%），以提高溶解度。此外，过量甲醇往往收缩或收紧凝胶，从而抑制大分子量蛋白质的转移。
	蛋白质的等电点处于或接近转印缓冲液的pH值	等电点与转印缓冲液的pH值相同的蛋白质将无净电荷，因而不会在电场中迁移。为了促进转移，尝试更高pH值的缓冲液，如10 mM CAPS缓冲液（pH 11），包括10%甲醇，或较低pH值的缓冲液，如乙酸缓冲液。
	当凝胶和/或转印缓冲液中使用尿素时，检测不佳	通过循环的缓冲液设置，或在冷室中运行转印，来降低温度。尿素受热会引起蛋白质的氨基甲酰化，从而改变蛋白质中氨基酸的电荷。这会影响抗体识别和结合所必需的表位。
	蛋白质转移不彻底	对凝胶染色，以检查残留蛋白质。如果转移不彻底，请检查您的转印技术。
	蛋白质保留不佳	一旦转印完成，确保膜彻底干燥，以实现蛋白质的最佳结合和固定。这应在下游检测之前完成。
无信号	蛋白质未转移	检查转移过程中凝胶和膜的方向。使用预染的分子量标准品来监控转移。
小分子量蛋白质的转移不佳	蛋白质保留不够，SDS干扰小分子量蛋白质的结合	换用Immobilon®-PSQ转印膜。去除转印缓冲液中的SDS。
	转印缓冲液中的甲醇浓度低	在转印缓冲液中使用较高比例的甲醇（15%-20%）。
	蛋白质结合的时间不够	较低电压可优化小蛋白与膜的结合。
	电流不能穿过膜。	将膜和滤纸切成与凝胶相同的大小；切勿超出。
大分子量蛋白质（~ >80 kDa）的转印不佳	甲醇浓度过高	甲醇浓度降低至10%（v/v）或以下能让凝胶溶胀，从而协助大分子量蛋白的转移。而且，较低比例的甲醇也会减少蛋白的SDS损失，减少凝胶中的蛋白沉淀。对于SDS对膜结合的干扰，>200 kDa的蛋白质不如<100 kDa的蛋白质灵敏。
正电荷蛋白质的转移不佳	蛋白质在转移缓冲液中带正电荷；蛋白质向阴极移动。	反转转印堆积层，让Immobilon® 转印膜在凝胶的阴极一侧。
半干转印不佳	电流绕过凝胶堆积层	确保膜和滤纸切成与凝胶相同的大小，切勿超出。
各种大小的蛋白质转移不佳	转移大蛋白和小蛋白需要不同的条件	请参考“宽分子量范围蛋白质的转移可能需要多步的转移”（T. Otter et al., Anal. Biochem. 162:370-377 (1987)） 在半干转印中使用三缓冲液系统。

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