张锋博士Nature Methods改良CRISPR筛选技术

此前，麻省理工Broad研究所的张锋博士领导研究团队，构建了一个全基因组范围内的CRISPR敲除文库（GeCKO），并在黑色素瘤模型中鉴定了对维罗非尼产生抵抗的突变。现在他们对整个体系进行了改进，并在七月三十日的Nature Methods杂志上展示了升级版的CRISPR敲除技术。

　　

生物通报道：律成簇的间隔短回文重复CRISPR与内切酶Cas9的组合，原本是细菌抵御病毒的重要武器，现在这一组合已经成为了一个通用工具，被用于在真核生物中进行位点特异性的基因组编辑。

由于这种基因组编辑技术更易于操作，也具有更强的扩展性，CRISPRs-Cas9迅速成为了科研领域的新宠儿。

此前，麻省理工Broad研究所的张锋（Feng Zhang，音译）领导研究团队，构建了一个全基因组范围内的CRISPR敲除文库（GeCKO），并在黑色素瘤模型中鉴定了对维罗非尼（Vemurafenib）产生抵抗的突变。这项研究表明，除了RNAi以外，人们也可以利用CRISPR/ Cas9系统在人和小鼠细胞中进行功能缺失性筛选。

然而，之前用于CRISPR筛选的慢病毒递送系统病毒滴度较低，还需要一个已经表达Cas9的细胞系。这无疑限制了这一技术的应用范围。

为此，Feng Zhang等人对整个体系进行了改进，并在七月三十日的Nature Methods杂志上展示了升级版的CRISPR敲除文库。Feng Zhang是麻省理工学院脑与认知科学助理教授、McGovern 脑研究所和Broad研究所核心成员。去年七月，Feng Zhang荣获了美国生物医学大奖：瓦利基金青年研究家奖（Vallee Foundation Young Investigator Award），奖金25万美元。其研究组研究方向为设计新的分子工具来操控活体大脑。

为了改进病毒包装和引导序列，研究人员构建了一个能生成高滴度病毒的新载体（lentiCRISPRv2）。研究显示，新载体的功能性病毒滴度比lentiCRISPRv1差不多提高了十倍。

他们为了进一步提高病毒滴度，还开发了一个双载体系统，通过不同的病毒载体分别递送Cas9 (lentiCas9-Blast)和sgRNA (lentiGuide-Puro)。其中，lentiGuide-Puro的功能性病毒滴度比之前的lentiCRISPRv1高了将近一百倍。研究人员发现，升级后的单载体和双载体系统都能有效介导基因敲除。不过双载体系统可以生成表达Cas9的细胞系，而单载体lentiCRISPRv2可能更适合活体应用或者原代细胞筛选。

此外，研究人员还设计并合成了新的人、小鼠GeCKOv2 sgRNA文库，进一步减少了脱靶效应，并且新增了约一千个原始GeCKO文库里没有的目标基因。（延伸阅读：Nature子刊：黄行许教授解决基因组编辑的脱靶问题）

这项研究中的小鼠、人文库都分为两个亚文库，每个亚文库有三个sgRNA与目标基因对应，还有一千个不靶向基因的对照sgRNA。研究者们可以选择将两个亚文库结合起来进行筛选，这样每个基因就对应六个sgRNA。在细胞数有限的情况下（例如使用原代细胞或活体筛选）也可以只采用一个亚文库。这些升级版的慢病毒载体和文库，进一步拓展了CRISPR筛选的应用范围。

 

生物通编辑：叶予

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