蛋白质印迹手册17：蛋白质观察[创新技巧]

下列操作介绍了对固定在Immobilon® PVDF转印膜上的蛋白质进行染色的典型步骤。注意：在观察一块染色的印迹时，当膜还是湿的时，对比度是最好的。在照相时，使用湿的印迹和透过膜的光。

提示：在免疫检测之前只能使用可逆染料或透照。
提示：为了观察微弱的条带，将甲醇浓度提高到40%。

1 通过透照法观察

透照法是一种非破坏性的可逆技术（Reig和Klein，1988）。这种方法是基于PVDF膜浸泡在甲醇中，会从不透明变为半透明。20%的甲醇会使包被有蛋白质的膜浸湿，而无蛋白质的区域不会。

提示：在开发一种新的转印操作或处理一种新的样品类型时，凝胶应被染色，以验证所有蛋白质是否从凝胶上彻底洗脱。
放置在光盒中，蛋白条带会表现为透明的区域。与照相结合使用时，检测灵敏度与考马斯亮蓝染料相当。

必需的设备和溶液
• 20%（v/v）甲醇
• 浅托盘，能容纳膜
• 白色光盒
• 黑纸

步骤
1. 利用操作1.7 膜干燥方法（第44页）中的一种方法，让印迹彻底干燥。
2. 在托盘中加入足量20%的甲醇，以覆盖印迹。
3. 将印迹放在20%甲醇中5分钟。
4. 将印迹放在光盒中，用一张黑纸遮盖印迹周围的区域。
5. 条带变成透明区域，而背景不透明（图10，印迹A，第24页）。
6. 如果需要永久记录，对湿的印迹照相。
7. 当所有甲醇干燥后，印迹将恢复成它原先的样子。

2 通过可逆染色观察

丽春红
这种染料产生浅色背景下的粉红条带。

必需的设备和溶液
• 染料：0.2%丽春红、1%乙酸。按1:10用1%（v/v）乙酸稀释储液（20%染料，溶于30%（w/v）三氯乙酸和30%（w/v）磺基水杨酸）而制备。
• 甲醇，100%。
• 0.1 N NaOH。
• Milli-Q® 水。
• 浅托盘，能容纳膜。

步骤
1. 如果印迹是干燥的，在100%甲醇中浸湿。
2. 在托盘中加入足量的染料，以覆盖印迹。
3. 将印迹放入染料中，摇动1分钟。
4. 取出印迹，用Milli-Q® 水彻底冲洗，直至达到所需的对比度。
5. 若要彻底去除染料，用0.1 N NaOH清洗印迹。

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CPTS（酞菁铜四磺酸）
这种染料产生浅色背景下的翠蓝色条带。

必需的设备和溶液
• 染料：0.05%（w/v）CPTS，溶于12 mM HCl。
• 脱色液I：12 mM HCl。
• 脱色液II：20%（v/v）甲醇。
• 甲醇，100%。
• 0.1 N NaOH。
• Milli-Q® 水。
• 蛋白脱色液：0.5 M NaHCO3。
• 浅托盘，能容纳膜。

步骤
1. 如果印迹是干燥的，在100%甲醇中浸湿。
2. 在托盘中加入足量的染料，以覆盖印迹。
3. 将印迹放入染料中，摇动1分钟。
4. 将印迹放入脱色液I中，去除多余的染料，达到所需的对比度。
5. 若要彻底去除背景中的染料，用脱色液II清洗印迹。
6. 若要使蛋白脱色，在蛋白脱色液中摇动，直至染料去除。

3 通过不可逆染色观察

考马斯亮蓝R染料
这种染料在浅色背景下产生深色条带。
切记：这种染料会干扰免疫检测。

必需的设备和溶液
• 染料：0.1%（w/v）考马斯亮蓝，溶于50%（v/v）甲醇和7%（v/v）乙酸。
• 脱色液I：50%（v/v）甲醇和7%（v/v）乙酸。
• 脱色液II：90%（v/v）甲醇和10%（v/v）乙酸。
• 甲醇，100%。
• Milli-Q® 水。
• 浅托盘，能容纳膜。

步骤
1. 如果印迹是干燥的，在100%甲醇中浸湿。
2. 在托盘中加入足量的染料，以覆盖印迹。
3. 将印迹放入染料中，摇动2分钟。
4. 取出印迹，用Milli-Q® 水短暂冲洗。
5. 将印迹放入脱色液I中，摇动10分钟，以去除过量的染料。
6. 将印迹放入脱色液II中，摇动10分钟，以彻底使背景脱色。

氨基黑
这种染料在浅色背景下产生深色条带。
切记：这种染料会干扰免疫检测。

必需的设备和溶液
• 染料：0.1%（w/v）氨基黑，溶于25%（v/v）异丙醇和10%（v/v）乙酸。
• 脱色液：25%（v/v）异丙醇和10%（v/v）乙酸。
• 甲醇，100%。
• Milli-Q® 水。
• 浅托盘，能容纳膜。

步骤
1. 如果印迹是干燥的，在100%甲醇中浸湿。
2. 在托盘中加入足量的染料，以覆盖印迹。
3. 将印迹放入染料中，摇动2分钟。
4. 取出印迹，用Milli-Q® 水短暂冲洗。
5. 将印迹放入脱色液中，摇动5-10分钟，以去除过量的染料。

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