吴森：无外源因子iPS诱导 实现高效率生殖传代

　　

生物通报道：iPS（诱导多能干细胞）技术可谓是近年来干细胞研究领域中“红得发紫”的一项新技术，最初是由日本京都大学山中伸弥等人利用四个转录因子实现的重编程，但是这一过程也充满了许多风险性和繁琐性。

近期来自中国农业大学，美国犹他大学等处的研究人员发表文章，首次获得了高质量的无外源因子的诱导多能干细胞（iPS细胞），能够应用于胚胎操作，并且能够产生健康的后代小鼠。

文章公布在《美国国家科学院院刊》(PNAS) 杂志上，这项研究由中国农业大学吴森实验室和犹他大学卡佩齐（Capecchi）实验室合作完成。其中吴森教授早年毕业于北京农业大学，主要研究方向为动物遗传工程及干细胞。

多能干细胞(Pluripotent stem cell，Ps)是当前干细胞研究的热点和焦点。它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。因此，多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。但是过去认为多能干细胞只能从人胚胎中获得。2007年，美国和日本科学家发现，应用人和鼠的正常皮肤细胞，导入KLF4、OCT4、SOX2和C-MYC四种基因，即可由正常体细胞转化成多能干细胞。这种基因诱导而产生的多能干细胞称为诱导多能干细胞(iPSC)。

无疑这种iPS细胞在再生医学领域具有重要的应用价值，但是传统的诱导方法是通过逆转录病毒或者慢病毒载体携带OKSM四因子，使iPS细胞具有潜在的致癌性，从而不能够应用到人类细胞治疗领域。

为了解决这个问题，在过去的几年里科学家们研发了各种方法，用于诱导产生无外源因子iPS细胞。这些方法包括质粒、piggyBac转座子、蛋白转导、mRNA和microRNA转染等。虽然这些方法能够产生无外源因子的iPS细胞，但是不能够稳定可靠地得到高质量的、具有生殖嵌合能力的细胞。

在最新这篇文章中，研究人员成功地将8个重编程因子和选择性标记基因放到一个非整合质粒中，从而获得了较高质量的非转基因（transgene-free）iPS细胞。这种方法在干细胞研究领域将会有重要的应用。

所谓非转基因（transgene-free）iPS细胞，就是指不需要外源重编程因子，就能获得或者维持多能性的iPS细胞。要获得这种iPS细胞，对质粒的要求比一般经典的四因子重编程方法要高。

“这种方法涉及的8个重编程因子分别是OCT4, SOX2, KLF4, MYC, NANOG, LIN28, NR5A2, MIR302/367。正筛选标记基因是neo，负筛选标记基因是tk。选用非整合质粒是为了在重编程完成以后，用负筛选将质粒很方便的去除”，吴教授解释道。

研究人员优化了重编程因子的组合，挑选了合适的筛选标记，并将这两者整合到一个非整合质粒中。更重要的是，研究人员发现pMaster12质粒能产生非转基因（transgene-free）的iPS细胞，这也就是说这种细胞在2i培养基中生长后，能应用于胚胎操作，并且能够产生健康的后代小鼠。

那么此前的研究是否也曾实现过这种高效率生殖传代呢？

吴教授表示，“此前没能够真正可靠的实现过，主要原因是之前获得的iPS细胞质量还不够好，无法像胚胎干细胞（ES) 那样很容易的实现生殖传代。”

吴教授也介绍了这种方法与其它方法的区别，他表示，这种新方法“不同主要在于我们用了更多的重编程因子，而且把8个重编程因子放到一个载体上。这样做一个优势是重编程效率更高，另一个好处是在重编程完成以后容易将外源质粒（因子）去除。”

这项研究对于解决iPS细胞中致癌性的问题具有重要的意义，也将有助于解析诱导多能干细胞形成的分子机理。据了解，中国农业大学的吴森研究小组正在尝试用同样的方法获得猪羊等大动物的无转基因iPS细胞。

原文摘要：
Efficient germ-line transmission obtained with transgene-free induced pluripotent stem cells

Significance
Using a single, nonintegrating episome, containing an optimized assembly of reprogramming factors and positive/negative selection markers, we generated germ-line–competent induced pluripotent stem (iPS) cells. To ensure that the iPS cells were transgene-free (i.e., were independent of exogenous reprogramming factors to achieve and maintain their pluripotent ground state) required the inclusion on the episome more that the classical four (POU5F1/OCT4, KLF4, SOX2, and cMYC) reprogramming factors. Also critical for the transgene-free iPS cells exhibiting competency for germ-line transmission was the requirement for growth in 2i medium.

Abstract
Induced pluripotent stem (iPS) cells hold great promise for regenerative medicine. To overcome potential problems associated with transgene insertions, efforts have been directed over the past several years to generate transgene-free iPS cells by using non-viral-vector approaches. To date, however, cells generated through such procedures have had problems producing reproductively competent animals, suggesting that their quality needed further improvement. Here we report the use of optimized assemblies of reprogramming factors and selection markers incorporated into single plasmids as nonintegrating episomes to generate germ-line–competent iPS cells. In particular, the pMaster12 episome can produce transgene-free iPS cells that, when grown in 2i medium, recapitulate good mouse ES cells, in terms of their competency for generating germ-line chimeras.

作者简介：
吴森，男，教授， 博士生导师

学习与工作经历
1988-1993 北京农业大学动物医学院，本科
1993-1998卫生部北京生物制品研究所，助理工程师
1998-1999加拿大University of Saskatchewan，读硕士研究生
1999-2006美国University of Utah，博士学位
2006-2010美国HHMI/University of Utah，博士后
2010-至今中国农业大学生物学院，教授

研究方向
动物遗传工程及干细胞

主讲课程
动物高级生理学与分子生物学