用CRISPR编辑HPV基因杀死宫颈癌细胞

最近，杜克大学的研究人员利用被称为CRISPR的基因组编辑工具，选择性地破坏两个负责宫颈癌细胞生长和存在的病毒基因，从而使癌细胞自我毁灭。相关研究结果发表在2014年8月7日的《病毒学杂志》（Journal of Virology）。

　　

生物通报道：最近，研究人员“劫持”了细菌通常用来抵御病毒感染的一种防御系统，并重定向它来对抗人乳头瘤病毒（HPV）——导致宫颈癌、头颈癌和其他癌症的病毒。

杜克大学的研究人员利用被称为CRISPR的基因组编辑工具，选择性地破坏两个负责宫颈癌细胞生长和存在的病毒基因，从而使癌细胞自我毁灭。

相关研究结果发表在2014年8月7日的《病毒学杂志》（Journal of Virology）。该研究相信，最近在哺乳动物细胞中才尝试的一种方法，可能为其他DNA病毒（如乙型肝炎和单纯性疱疹病毒）的抗病毒策略，指出了一条新的途径。

本文资深作者、杜克大学医学院分子遗传学教授Bryan R. Cullen称：“因为这种方法只靶定病毒基因，对正常细胞应该没有脱靶影响。你可以把它看作是，靶定一个导弹，该导弹将摧毁一个特定的目标。你提交一个代码告诉导弹真正要打击的是什么，而且它只会击中那个目标，它不会击中别的东西，因为它没有击中其他目标的代码。”

CRISPR靶向系统仅发现于十年前。研究人员着眼于不同类型细菌的基因组，他们注意了很长一段时间，相同的基因序列在哪里重复。在这些重复的DNA在细菌与细菌之间有所不同。科学家们发现，这些独特的序列——称为clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR），来自于先前感染细菌的病毒。

基本上，细菌每一次被感染，它们都会复制一段入侵的病毒DNA，并将重复元素之间的这些序列收集起来将来用作参考。然后，这些序列会为一个称为Cas9的细菌蛋白提供一个目标名单，这个蛋白作为一种新型枪手，可在任何公认的入侵者再次伤害细菌之前，切断和破坏它们。

最近，几个实验室已经表明，他们可以重定向CRISPR系统，达到自己的目标；一些研究人员引入他们想在模式生物中研究的突变，其他一些研究人员修复类似于DMD基因（参与肌营养不良症）缺陷的遗传缺陷。

在这项研究中，Cullen决定靶定人乳头瘤病毒（HPV），这种病毒引起了几乎所有的宫颈癌和大约一半的头颈癌。特别是，他和他们的同事们靶定病毒基因E6和E7——两个“癌基因”，可阻止宿主自身对癌细胞的抑制。

为了运行CRISPR对抗病毒，研究人员需要两种成分。首先，他们需要E6和E7的目标代码，由短的RNA序列段（DNA的化学伙伴）组成。他们向这种“引导RNA”中添加了Cas9蛋白，这种蛋白会切断任何可排成行并结合那些RNA序列的DNA。

研究人员将这种抗病毒混合物包装入一个基于HIV禁用版本的病毒载体中。在实验室培养皿中，他们用这种基因工程病毒感染宫颈癌细胞，并评估它是否能有效地消灭HPV感染并阻止癌细胞的生长。

结果他们发现，接受抗HPV引导RNA/Cas9混合物的肿瘤细胞立即停止生长。相反，接受控制病毒（含有随机引导RNA序列）的细胞，仍然继续它们永生的道路。

然后，研究人员深入到分子水平，探讨在癌细胞中破坏E6或E7的后果。E6通常阻断称为p53的蛋白质，p53被称为基因组的守护者，因为当它感觉到有哪里出问题时，可以打开细胞中的自杀通路。在这项研究中，靶定E6可让p53能够恢复其正常功能，促进肿瘤细胞的死亡。

E7以类似的方式运转，阻断另外一个称为视网膜母细胞瘤（Rb，可以触发生长停滞和衰老——另一种形式的细胞死亡）的蛋白质。正如预期的那样，研究人员发现，靶定E7也再次启动这个第二“抑癌基因”。Cullen说：“只要你关闭E6或E7，宿主防御机制就会再次恢复。发生的情况是，细胞立即自杀。”

Cullen及其同事们正在致力于开发一种以腺相关病毒为基础的不同病毒载体，将他们的CRISPR货物传递到癌细胞中。一旦他们对新的传递系统满意，他们将首先在动物模型中测试这种方法。

Cullen说：“在HPV诱导的肿瘤中，我们希望看到的是，E6或E7缺失可迅速地诱导肿瘤的坏死。这种方法有可能成为一种单一冲击疗法，将大大减少肿瘤负荷，而不会对正常细胞有任何影响。”

研究人员也正在靶定利用DNA作为其遗传物质的其他病毒，包括乙型肝炎病毒和单纯疱疹病毒。

（生物通：王英）

延伸阅读：厦大学者利用CRISPR/Cas9系统编辑疟原虫基因组

生物通推荐原文摘要：
Inactivation of the human papillomavirus E6 or E7 gene in cervical carcinoma cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided endonuclease
Abstract：High-risk human papillomaviruses (HPVs), including HPV-16 and HPV-18, are the causative agents of cervical carcinomas as well as being linked to several other tumors of the anogenital and oropharyngeal regions. The majority of HPV-induced tumors contain integrated copies of the normally episomal HPV genome that invariably retain intact forms of the two HPV oncogenes E6 and E7. E6 induces degradation of the cellular tumor suppressor p53, while E7 destabilizes the retinoblastoma (Rb) protein. Previous work has shown that loss of E6 function in cervical cancer cells induces p53 expression as well as downstream effectors that induce apoptosis and cell cycle arrest. Similarly, loss of E7 allows increased Rb expression, leading to cell cycle arrest and senescence. Here, we demonstrate that expression of a bacterial Cas9 RNA-guided endonuclease, together with single guide RNAs (sgRNAs) specific for E6 or E7, is able to induce cleavage of the HPV genome, resulting in the introduction of inactivating deletion and insertion mutations into the E6 or E7 gene. This results in induction of p53 or Rb, leading to cell cycle arrest and eventual cell death. Both HPV-16 and HPV-18-transformed cells were found to be responsive to targeted HPV genome-specific DNA cleavage. These data provide proof of principle for the idea that vector-delivered Cas9/sgRNA combinations could represent effective treatment modalities for HPV-induced cancers.