蛋白质印迹手册14：湿转操作详解[创新技巧]

手册的这一节是最常用的蛋白质印迹操作的概要。这些方法是通用的，适用于所有市售的检测试剂。它们可利用众多技巧来优化，包括本节中的技巧。这些优化技巧是默克密理博公司多年来关于转印膜和印迹经验的结晶，也来自参考文献和客户的反馈。

提示：乙醇或异丙醇可替代转印缓冲液中的甲醇。
提示：转印缓冲液中的SDS（最高0.05%）可提高转移效率，但也有可能降低膜对蛋白的截留。
提示：预切好的Immobilon® 转印膜与所有标准尺寸的迷你胶及常用的电泳系统兼容（第8和9页的表）。
            建议 – 在槽转印之前预冷转印缓冲液。
提示：较厚的凝胶或较大的蛋白质可能需要较长的转印时间或增加场强。真正的转印条件应针对每个系统来优化。
提示：转印缓冲液中的甲醇（8-20%）降低蛋白从膜上的洗脱效率，但改善PVDF转印膜的吸附。
提示：由于PVDF的疏水性质，膜需要用醇类浸润。
提示：Tris甘氨酸缓冲液会在N端测序中产生较高的背景。如果蛋白质要通过Edman降解来测序，可使用CAPS或TBE缓冲液。
提示：在分析较小分子量的蛋白质时，可用0.2 μm Immobilon®-PSQ转印膜来替代0.45 μm Immobilon®-P转印膜。
提示：在荧光检测方法中使用0.45 μm Immobilon®-FL转印膜

蛋白质转印

操作1.1 电泳转印：槽（湿）转印

下列操作介绍了利用槽转印系统将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）转移到Immobilon® PVDF转印膜的标准步骤。关于更多信息，请查看您的槽转印系统附带的操作指南。

必需的设备和溶液

• 包含已分辨蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶。
• Immobilon® PVDF转印膜，切成与凝胶相同的大小（带有缺角，以便定位）。
• 两张Whatman® 3MM滤纸或类似产品，切成与凝胶相同的大小。
• 两块泡沫垫（例如，Scotch Brite® 垫）。
• 槽转印系统，可容纳凝胶。
• 甲醇，100%
• Milli-Q® 水
• Tris/甘氨酸转印缓冲液：25 mM Tris碱、192 mM甘氨酸、10%（v/v）甲醇，pH 8.3；或CAPS缓冲液：10 mM 3-环己胺-1-丙磺酸（CAPS）、10%（v/v）甲醇，pH 11（用NaOH调整）。

注意：两种缓冲液都制备成10X储液，在使用前与甲醇混合。

准备

1. 准备足够的转印缓冲液来装满转印槽，以及另外200 mL来平衡凝胶和膜，并润湿滤纸。
2. 从转印夹中取出凝胶；切掉积层胶和点样孔。
3. 将凝胶浸泡在转印缓冲液中10至30分钟。
4. 将滤纸浸泡在转印缓冲液中至少30秒。
5. 准备转印膜：
a. 将膜在甲醇中浸泡30秒。膜应均匀地从不透明变成半透明。
b. 小心将膜放入Milli-Q® 水中，浸泡2分钟。
c. 小心将膜放入转印缓冲液中，至少平衡5分钟。

转印堆积层的组装

1. 打开凝胶支架转印夹。
切记：为了确保均匀的转移，请在堆积层中每一层的表面小心滚动移液管或搅拌棒，以去除气泡。不要施加过大的压力，以防止损坏膜和凝胶。
2. 将泡沫（纤维）垫放在卡盒的一侧。
3. 将一张滤纸放在泡沫垫上。
4. 将凝胶放在滤纸上。
5. 将膜放在凝胶上。
6. 将第二张滤纸放在堆积层上。
7. 将第二个泡沫垫放在滤纸上。
8. 盖上凝胶支架转印夹。

完整的转印堆积层应如下所示：

蛋白质转印

1. 将凝胶支架转印夹放入转印槽中，让凝胶一侧面对阴极（-），膜一侧面对阳极（+）。
2. 在槽内加入足够量的缓冲液，以覆盖转印夹。
3. 将黑色阴极引线（-）插入转印装置的阴极插孔，将红色阳极引线（+）插入阳极插孔。
4. 将阴极引线和阳极引线连接到相应的功率输出。
5. 如果有的话，根据制造商的指引设置转印槽的冷却装置。
6. 开启系统，以6-8 V/极间距离运行1-2小时。按照转印槽制造商的指引，并参考蛋白质从凝胶转移到膜上（第16页），了解优化细节。
7. 在转印完成后，从转印槽中取出转印夹。
8. 利用镊子，小心拆卸转印堆积层。

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